松江鲈Myostatin基因内含子和线粒体D-loop DNA序列分析

邵 芳，费晓燕，卢祥云，徐建荣，顾志良

（常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

松江鲈（Trachidermus fasciatus）属鲉形目，杜父鱼科，松江鲈属.近年来由于资源枯竭，种群濒危，已被列为国家二级保护动物.目前对松江鲈的研究主要集中在生态、生理、胚胎发育与繁殖习性等方面[1].为有效保护和合理利用松江鲈资源，对其种群遗传结构和遗传多样性的研究就显得尤为重要．

肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)作为骨骼肌生长发育的负调节因子[2]，引起生物学家的广泛关注.弄清MSTN基因的结构和功能对阐明骨骼肌生长发育的调控机理具有重要意义.研究表明鱼MSTN基因由三个外显子和两个内含子组成[3-5]，我们对松江鲈MSTN基因的全长cDNA和组织表达特异性作了研究[6]，但目前对松江鲈MSTN基因的内含子序列尚未有报道.mtDNA是独立于细胞核基因组外的环状双链DNA分子，在mtDNA上存在一个独特的D-loop结构，是整个线粒体基因组序列和长度变异最大的区域，其进化速度最快.线粒体DNA的D-loop区可用于研究物种起源和进化以及种内种群的系统进化分析，探讨物种在进化过程中可能发生的变异情况.鱼类mtDNA是一个相对独立的复制单位，具有分子小、结构简单、重组率低、进化速度快、不同区域进化速度有差异等特点，是鱼类进化遗传学、分子生态学、遗传多样性及其保护生物学等研究的重要标记[7]．

本研究对MSTN基因内含子1、2以及长江、丹东和葫芦岛的松江鲈线粒体D-loop区扩增和测序，检测不同地理群体松江鲈线粒体D-loop区的多态性，探索种群内和种群间的遗传多样性状况，为今后松江鲈的资源保护、开发和养殖提供相应的理论依据．

1 材料与方法

1.1 实验材料：

本实验所用的松江鲈来自长江（C）、丹东（D）、葫芦岛（H）三个地理群体.实验所用材料由苏州市长江特色水产繁殖工程中心提供.将鱼宰杀后取肌肉组织在-80℃冰箱中保存备用，用酚-氯仿法提取基因组DNA．

1.2 引物设计与合成

根据我们克隆的松江鲈Myostatin基因cDNA序列（Genbank登录号：GU198192)，以及斑马鱼和鲤鱼Myostatin基因DNA序列（Genbank登录号：AY693972，GQ214770），分别设计引物Sjl intr1 F1/R1，Sjl intr2 F1/R1以扩增松江鲈Myostatin基因的内含子1和内含子2序列.根据GenBank数据库中已公布松江鲈线粒体D-loop部分序列（Genbank登录号：AB188172），设计引物SjldpF1/R1，扩增松江鲈D-Loop部分片段，以分析不同地理群体的关系.引物由上海生工生物工程有限公司合成．

表1 实验所用的引物序列

1.3 松江鲈Myostatin基因内含子的PCR扩增和克隆

PCR扩增在25μL反应体系中进行：0.2μL ExTaq酶（5U·μL-1，TaKaRa Tokyo，Japan），2.5μL10×PCR ExTaq Buffer（with Mg2+），2μL dNTP（2.5mmol·L-1each），Sjl intr1 F1和Sjl intr1 R1各1μL（10μM），基因组DNA（100ng/μL）1μL，加灭菌水至25μL.PCR扩增条件为95℃变性3min；然后在95℃ 30 Sec，60℃30Sec，72℃1.5min，进行30次循环；72℃延伸10min；4℃保存.将PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段.将回收片段克隆到PCR2.1 Vector（Invitrogen，美国）中，挑取阳性菌落，于LB液体培养基（Amp+）中摇菌培养，提取质粒，经鉴定后将重组质粒送往上海桑尼生物科技公司进行测序．

1.4 不同地理群体线粒体D-loop序列扩增和序列测定

PCR扩增反应体系和反应条件同上述1.3.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收纯化目的片段，直接测序．

1.5 数据分析

将获得的序列在DNAMAN5.0软件上进行分析，并进行物种间同源性比较.利用MEGA4.1软件中的Kimura 2-parameter法计算净遗传距离矩阵，以距离矩阵邻接法（Neighbor-Joining，NJ）建系统发生树，通过自引导检验（bootstrap）获得系统分支的置信度（重复次数为1000）．

2 结果与分析

2.1 松江鲈MSTN基因内含子的扩增

以松江鲈基因组DNA为模板，用引物Sjl intr1F1/R1和Sjl intr2F1/R1进行PCR扩增，PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳检测（图1）.电泳检测结果显示，分别得到了450bp和1000bpPCR扩增产物，与设计的目的片段长度相同.将这两个片段分别回收后克隆到PCR2.1载体中，经测序后获得了两个片段的核苷酸序列，与松江鲈的MSTN基因cDNA序列比对，确认该序列为松江鲈MSTN基因的内含子1和内含子2序列．

图1 松江鲈MSTN基因内含子PCR扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳图

2.2 松江鲈MSTN基因内含子的序列分析

通过PCR扩增并克隆测序后获得了松江鲈MSTN基因内含子1和内含子2的序列，内含子1长度为325bp，内含子2长度为835bp（图2和3），两个内含子的两端都符合GT-AG规则.在内含子2中发现了一个（AC）14的微卫星序列．

图2 松江鲈MSTN基因的内含子1序列

图3 松江鲈MSTN基因的内含子2序列

根据对其他物种MSTN基因序列的分析，发现鱼类中存在几种MSTN基因，包括MSTN1a，MSTN1b，MSTN2a，MSTN2b4种基因，且每个物种的MSTN基因都是含有两个内含子，三个外显子，不同物种的内含子长度不尽相同[6，8-10].表2为不同物种MSTN基因的内含子长度，可以发现有的物种中内含子1比内含子2长，有的物种内含子2比内含子1长.斑点叉尾鮰的MSTN内含子1最长为1748bp，瘤棘鲆MSTN内含子1最短为244bp，斑马鱼MSTN-2的内含子2最长为2201bp，尖吻鲈的MSTN内含子2最短为188bp.而我们得到的松江鲈MSTN基因的内含子2比内含子1长．

2.3 不同地理群体松江鲈的线粒体D-loop序列比较

对分别来自长江、丹东、葫芦岛三个不同地理群体的松江鲈18个个体线粒体D-loop片段进行了PCR扩增和测序.用DNAMAN软件对这18个个体进行序列比对后，共发现19个多态位点，但是未发现具有地理群体特征的单倍型.将这18个个体用MEGA软件绘制N-J进化树，也未发现三个地理群体松江鲈的特征性差异．

表2 不同物种MSTN基因内含子的长度比较

3 讨论

本研究根据松江鲈MSTN的cDNA序列设计引物，获得了松江鲈MSTN基因的内含子1和内含子2序列，该序列符合真核基因内含子的特征.在内含子2中发现了1个（AC）14的重复序列.研究表明，已在多种哺乳动物的MSTN基因中发现微卫星序列，De la Rosa-Reyna（2006）在牛MSTN内含子1中的T-motif中发现了（TG）微卫星[11]；姜运良（2004）在猪MSTN侧翼区发现（TG）13的微卫星标记[12].在鱼类的MSTN基因中也发现了微卫星序列：金鲷MSTN内含子Ⅱ和3′-UTR区内都存在(AC)n重复序列[4]，石鼓鱼MSTN序列的3′-UTR区存在(AC)29微卫星序列[13]；大黄鱼肌肉生长抑制素基因的3′-UTR区存在（CA）n微卫星序列，且该微卫星座位与大黄鱼体长和体重存在轻度的正相关[14]．

对物种进化的分子生物学研究目前主要集中在线粒体DNA方面，多数主要依赖于线粒体D-loop的信息，我们检测到了松江鲈不同个体间的D-Loop区序列存在差别，但是三个地理群体未发现明显的地理序列特征.可能是由于这些地理群体分隔时间短，没有明显大的差别.这一结果在对松江鲈MSTN基因序列多态性的检测时一定程度上得到了验证，在松江鲈MSTN基因的两个内含子和3′-UTR区未发现多态性位点（未发表资料），三个地理群体之间没有明显差异，一方面说明了MSTN基因比较保守，另一方面，可能也是由于这几个地理群体的松江鲈分隔时间短.我们将进一步检测其他线粒体基因中的变异情况，加入其他基因的信息，分析这些地理群体的松江鲈之间进化的关系．

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