三七总皂苷对免疫性肝损伤小鼠的保护作用

洪 梅,孙文静,毕 昱

(解放军532医院,安徽黄山,245000)

三七总皂苷(PNS)是中药三七中有效成分, 研究表明其具有调节免疫、抗纤维化、抗感染、降低心肌耗氧量、扩张血管、清除自由基、抑制血小板凝集等药理学作用[1]。本试验以BCG加LPS诱导小鼠免疫性肝损伤模型,研究PNS对其的保护作用,为PNS在临床进一步应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

三七总皂苷,含量>98%,南京泽朗医药科技有限公司;联苯双酯(biphenyldicarboxylate,BP),北京协和药厂;医用卡介苗(bacillus calmette guein,BCG),卫生部上海生物制品研究所;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),美国Sigma公司;ALT 、AST 、SOD、MDA 、GSH-Px 试剂盒 ,南京建成生物工程研究所;TNF-α、IL-1β试剂盒,北京普尔伟业生物科技有限公司;兔抗鼠TGF-β1、NF-κ B单克隆抗体、DAB显色试剂,武汉博士德生物工程有限公司;T RIZOL Reagent试剂,美国Invitrogen life technologies公司;Reverse Transcription System逆转录试剂盒、PCR试剂盒,加拿大Fermentas公司。

1.2 动物

昆明种小鼠,雄性,体质量18～22 g,由南京医科大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(苏)2008-0004。自由摄食和饮水,保持室内温度18～22℃,相对湿度40%～60%。

1.3 仪器与设备

电子天平JT12001,上海精天电子仪器厂;全自动高速冷冻离心机GL20A,湖南仪器仪表总厂离心机厂;722S分光光度计,上海精密科学仪器有限公司;电子显微镜XDS-1B,重庆光电仪器总公司;Hema18R冷冻离心机、压缩机制冷式基因扩增仪、GSG2000核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统,珠海黑马医学仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制备[2]:昆明种小鼠,雄性,体质量18～22 g,随机分为正常组、模型组、PNS 100、200、400 mg/kg组、阳性药物组(联苯双酯 150 mg/kg),每组15只,造模第1天除正常组外,其余各组每只小鼠尾部静脉注射(iv)BCG 12.5 mg/mL(约含5×107个活菌数),各治疗组ig给予相应药物;正常组和模型组ig给予等容积溶媒,连续10 d。第10天,除正常组iv给予等容积溶媒外,其余各组每只小鼠iv LPS 37.5 μ g/mL。注射后禁食16 h,自小鼠后眼眶静脉丛采血,颈椎脱臼处死小鼠,称取脾脏、肝脏重量计算脏器指数。

1.4.2 血清ALT 、AST 、TNF-α、IL-1β 含量测定 :常规制备血清标本,按照试剂盒说明书测定ALT 、AST 、TNF-α、IL-1β 含量 。

1.4.3 肝组织匀浆MDA、SOD、GSH-Px含量测定:取肝脏左叶少许,冰生理盐水冲洗、滤纸吸湿后,在相同部位精确称取0.3 g,加入预冷的生理盐水,在冰水中制成10%的匀浆,4℃3 000 r/min离心15 min,提取上清液,按照试剂盒说明书测定SOD、MDA 、GSH-Px含量 。

1.4.4 HE染色法肝组织病理学检查:取肝右叶相同部位,大小约1 cm×1 cm×0.5 cm的肝组织小块,放入 10%甲醛溶液中固定,然后脱水,透明,石蜡包埋,做常规HE染色,光镜下观察组织病理学变化。

1.4.5 免疫组织化学技术检测肝脏TGF-β1、NF-κ B的表达:肝组织用10%甲醛固定,石蜡包埋,4 μ m连续切片,采用柠檬酸钠缓冲液热抗原修复;SP免疫组织化学染色,苏木素对比染色;已知阳性切片;阴性对照:用PBS代替一抗阴性对照的方法,检测肝组织中 TGF-β1、NF-κ B的表达。

1.4.6 RT-PCR测定肝组织TNF-amRNA表达:取100 mg小鼠肝脏组织,采用 TRIzol法抽提RNA,总反应体系20 μ L,42 ℃水浴1 h,合成第一链cDNA。取上述逆转录产物1 μ L作为反应模板 ,反应体系为 25 μ L。 TNF-a Forward:5′-CTAGTACCGAGATGTGGAACTGGC-3′;Reverse:5′-CTGGCTCAGCCACTCCAGC-3′。扩增条件为:94℃预变性5 min,94℃变性40 s,58℃退火40 s,72℃延伸1 min,33个循环,再72℃延伸 10 min,4 ℃保存 。β-action Forward:5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′;Forward:5′-ACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。扩增条件为:94℃预变性5 min,94℃变性40 s,51℃退火40 s,72℃延伸1 min,32个循环,再72 ℃延伸 10 min,4℃保存。以5 μ L PCR产物在凝胶上电泳,摄像,存入计算机,并作图像分析。

2 结 果

2.1 三七总皂苷对小鼠脏器指数的影响

与正常组相比,模型组小鼠肝、脾系数明显高于正常组(P<0.01);三七总皂苷高、中剂量组和联苯双酯组均有抑制肝脾增大的作用,与模型组对比差异显著(P<0.05或者P<0.01),结果见表1。

表1 三七总皂苷对小鼠脏器指数的影响(±s,n=10)

表1 三七总皂苷对小鼠脏器指数的影响(±s,n=10)

与正常组比较,△△P<0.01;与模型组比较,＊P<0.05,＊＊P<0.01。

组别 剂量(mg/kg)肝指数(mg/10 g)脾指数(mg/10 g)正常组 - 551.35±60.40 53.95±4.95模型组 - 704.72± 90.94△△ 101.64±19.27△△三七总皂苷组 100 629.13±83.05 89.12±22.24 200 612.49± 89.18＊ 84.70±13.45＊400 600.13±109.10＊＊ 81.64±15.75＊＊联苯双酯组 150 603.72±74.78＊ 83.58±16.17＊

2.2 对小鼠血清ALT、AST含量的影响

与正常组相比较,模型组小鼠血清ALT、AST水平明显升高(P<0.01);三七总皂苷各剂量组和联苯双酯组均能显著降低小鼠血清中升高的ALT、AST活性,与模型组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01),提示三七总皂苷对免疫性肝损伤小鼠具有保护作用,结果见表2。

表2 三七总皂苷对血清ALT、AST含量的影响(±s,n=10)

表2 三七总皂苷对血清ALT、AST含量的影响(±s,n=10)

与正常组比较,△△P<0.01;与模型组比较,＊P<0.05,＊＊P<0.01。

组别 剂量(mg/kg)ALT(U/L)AST(U/L)正常组 - 44.65±10.99 50.55±8.38模型组 - 81.85±22.59△△ 99.15±20.50△△三七总皂苷组 100 64.35±17.21＊ 80.50±18.33＊200 62.65±21.41＊ 79.35±24.63＊400 59.80±13.76＊＊ 76.80±20.27＊联苯双酯组 150 57.55±18.61＊＊ 74.70±19.28＊＊

2.3 对小鼠肝组织MDA、SOD、GSH-Px的影响

与正常组比较,模型组小鼠血清MDA水平均显著升高,SOD、GSH-Px水平显著下降;与模型组比较,三七总皂苷低、中、高剂量组能显著降低免疫性肝损伤小鼠升高的MDA水平,升高其低下的SOD、GSH-Px水平,表明三七总皂苷通过提高机体抗脂质过氧化能力对免疫性肝损伤小鼠起保护作用,结果见表3。

表3 三七总皂苷对小鼠肝组织MDA、SOD、GSH-Px含量的影响(±s,n=10)

表3 三七总皂苷对小鼠肝组织MDA、SOD、GSH-Px含量的影响(±s,n=10)

与正常组比较,△△P<0.01;与模型组比较,＊P<0.05,＊＊P<0.01。

组别 剂量(mg/kg) SOD(U/mg·prot) MDA(nmol/mg·port) GSH-PX(U/mg·prot)正常组 - 144.81±19.39 5.93±1.57 242.34±32.36模型组 - 100.87±24.07△△ 9.64±2.47△△ 161.64±19.53△△三七总皂苷组 100 124.28±22.23＊ 7.79±2.11＊ 192.40±36.31＊200 125.98±24.44＊ 7.69±1.58＊ 197.19±20.77＊400 132.32±25.66＊＊ 7.29±2.40＊ 205.80±36.19＊＊联苯双酯组 150 129.05±27.96＊ 7.45±1.77＊ 216.87±39.36＊＊

2.4 对小鼠血清TNF-α、IL-1β的影响

与正常组比较,模型组小鼠血清TNF-α、IL-1β水平均显著升高;与模型组比较,三七总皂苷低、中、高剂量组及联苯双酯组均能显著降低肝损伤小鼠升高的TNF-α、IL-1β水平,表明三七总皂苷对免疫性肝损伤小鼠具有保护作用,其机制可能与调节细胞因子的产生有关,结果见表4。

2.5 对小鼠肝组织病理学的影响

表4 三七总皂苷对小鼠肝组织TNF-α、IL-1β含量的影响(±s,n=10)

表4 三七总皂苷对小鼠肝组织TNF-α、IL-1β含量的影响(±s,n=10)

与正常组比较,△△P<0.01;与模型组比较,＊P<0.05,＊＊P<0.01。

组别 剂量(mg/kg)TNF(μ g/L)IL(μ g/L)正常组 - 1.76±0.43 4.00±0.81模型组 - 3.42±1.02△△ 5.91±1.07△△三七总皂苷组 100 2.73±0.62＊ 4.93±1.10＊200 2.27±0.75＊ 4.88±1.11＊400 2.51±0.77＊＊ 4.84±1.14＊联苯双酯组 150 2.42±0.68＊＊ 4.87±0.99＊

正常组肝细胞结构清晰,肝细胞核大而圆,核膜清晰,核仁明显,胞质丰富,汇管区无炎性细胞浸润,结构清晰可见(图1.A);模型组肝细胞呈较广泛的嗜酸性坏死,肝细胞肿胀较明显,有炎细胞浸润(图1.B),表明模型复制成功;联苯双酯组仍有部分嗜酸性病变,水样改变、炎细胞浸润减轻(图1.F);PNS不同剂量组有个别嗜酸性病变细胞,水样改变基本消失,大部分肝细胞结构正常(图 1.C 、D、E)。

2.6 对血清 TGF-β1、NF-κ B 表达的影响

与正常组相比,模型组小鼠肝组织 TGF-β1、NF-κ B在胞质、胞核广泛大量表达;与模型组相比,三七总皂苷低、中、高各剂量组小鼠肝组织TGF-β1 、NF-κ B 表达量明显下 降,其中高剂量组肝组织完好,结果分别见图2、图3。

A.正常组;B.模型组;C.三七总皂苷(100 mg/kg)组;D.三七总皂苷(200 mg/kg)组;E.三七总皂苷(400 mg/kg)组;F.联苯双酯(150 mg/kg)组

A.正常组;B.模型组;C.三七总皂苷(100 mg/kg)组;D.三七总皂苷(200 mg/kg)组;E.三七总皂苷(400 mg/kg)组;F.联苯双酯(150 mg/kg)组

2.7 对肝组织TNF-amRNA表达的影响

RT-PCR结果分析显示,模型组大鼠肝脏TNF-amRNA的表达显著高于正常对照组,而三七总皂苷干预组TNF-amRNA的表达显著下降,结果见图4。

图4 三七总皂苷对免疫性肝损伤小鼠肝组织中TNF-amRNA表达的影响

3 讨 论

BCG+LPS诱导的免疫性肝损伤小鼠是广泛应用于肝病防治药物筛选的经典模型[3-4]。其机制为:预先给小鼠注射BCG可使多核中粒细胞或巨噬细胞聚集于肝,继后再用低剂量LPS攻击注射,可激发这些细胞释放对肝细胞有毒性作用动物多种免疫效应分子,如氧自由基、细胞因子等,这些分子的过度释放,可引发免疫性肝损伤[5]。

肝脏是含酶丰富的脏器,肝脏出现任何原因导致的肝组织损伤或细胞破坏、坏死时,酶从细胞内逸出进入血液,血清中ALT、AST活性将明显升高。因此,血清ALT、AST的升高是肝损伤的重要标志,转氨酶在一定程度上反映了肝细胞损害和坏死程度[6-7]。与正常组比较,模型组小鼠血清中AST和ALT活力升高,肝细胞受到明显损伤;而经PNS治疗后,各剂量组均可不同程度的降低肝损伤小鼠血清AST、ALT的升高,以上结果提示PNS对小鼠免疫性肝损伤具有良好的保护作用。同时,病理组织学检查显示,正常对照组小鼠肝组织结构清晰,肝细胞形态规则;模型组小鼠肝脏组织出现充血、肿大,炎性细胞浸润,肝细胞出现大片嗜酸性病变,表明免疫性肝损伤模型复制成功。PNS不同剂量组有个别嗜酸性病变细胞,水样改变基本消失,大部分肝细胞结构正常。

脂质过氧化在免疫性肝损伤的发生发展过程中起重要作用。MDA是脂质过氧化的最终产物,其含量与脂质过氧化反应呈正比;而作为抗氧化酶系统主要物质之一的SOD含量高低反映了机体清除氧自由基的能力;GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶,一般认为它在细胞内能清除有害的过氧化物代谢产物,阻断脂质过氧化链锁反应,从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用[8-9]。试验结果表明三七总皂苷可明显降低免疫性肝损伤小鼠升高的MDA水平,升高肝脏中降低的SOD、GSH-Px活力,表明PNS对免疫性肝损伤具有保护作用,其机制可能与提高机体脂质过氧化功能有关。

细胞因子NF-κ B可诱导与免疫和炎症有关的多种基因的转录,这些基因编码的蛋白包括有TNF-α、IL-1β细胞因子以及单核细胞趋化蛋白-1。TNF-α是参与特异性和非特异性免疫肝脏损伤的重要介质,主要是由活化单核巨噬细胞产生的细胞因子,能够增强T、B淋巴细胞及单核巨噬细胞的活性,TNF-α产量增加,刺激机体产生IL-1。综上所述PNS对免疫性肝损伤小鼠具有保护作用,其机制可能与通过下调NF-κ B的表达、抑制细胞因子TNF-α、IL-1β的分泌有关[10]。

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