小鼠CD8分子α链在SP2/0细胞中的表达及鉴定

钱 莉,潘兴元,龚卫娟,季明春

(扬州大学医学院,江苏扬州,225001)

许多细胞因子如 IL-1、IL-15、TGF-β、TNF-α、M-CSF等,除了经典的可溶性形式以外,还以膜结合形式存在[1]。细胞因子的这两种形式存在着功能上的差异。如膜结合型的IL-15比其可溶状态具有更强的刺激NK细胞扩增的作用[2-3];膜结合型TNF-α通过效应细胞与靶细胞的直接接触而发挥局部杀瘤效应,故毒副反应比可溶性TNF-α小,而且其杀瘤谱比可溶性 TNF-α广。目前主要通过基因工程的方法构建膜型细胞因子:将细胞因子的成熟肽基因与跨膜分子的跨膜区和胞内区编码基因连接,构成嵌合基因,使细胞因子由可溶性表达变为膜型表达[4]。常用的跨膜分子有 TNF、CD4和CD8分子等[5]。本研究主要运用基因工程的方法获得CD8分子α链的重组表达载体,并将其表达在SP2/0细胞的表面,为进一步构建膜型细胞因子奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

TRizol购自美国Gibco BRL公司;细胞总RNA试剂盒、质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒均购自上海飞捷生物公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成;dNTP购自MBI Fermentas;PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶均购自日本 TaKaRa公司;抗CD8α磁珠购自德国Miltenyi Biotec;FITC和 PE标记的抗CD8α单抗以及同型对照抗体均购自美国BD Phar ming公司。

1.2 磁珠分选CD8α+T细胞及纯度检测

无菌分离获取C57BL/6J小鼠的脾脏,用无菌针芯将脾脏磨碎,经孔径为0.037 mm钢网滤过并收集单细胞,Tris-NH4Cl裂解红细胞,PBS洗涤2遍,用磁珠标记的抗小鼠CD8α单抗4℃标记15 min,PBS洗涤1遍,经磁式分选仪阳性分选CD8α+T细胞。取 2×105经磁珠分选的CD8α+T细胞,离心压积,去上清。混匀细胞,大鼠血清封闭,4℃孵育10 min。加入PE标记的抗CD8α单抗,4 ℃孵育 15 min。PBS洗1次,流式细胞仪(FACSCalibur)检测,实验数据采用CellQuest软件分析。

1.3 重组pVITRO/CD8α表达载体的构建

取磁珠分选得到的CD8α+T细胞,用trizol常规抽提RNA,以Oligo(dT)n为引物,反转录mRNA生成cDNA。用primer 5.0软件设计扩增CD8α的引物,两端分别加BamH I和Sal I的酶切位点及保护性碱基。上游引物序列为 5′-TCAGGATCCATGGCCTCACCGT TGACCC-3′,下游引物序列为 5′-ACTGTCGACT TACACAATTTTCTCTGAAGGTCT-3′。PCR 扩增程序为:98℃预变性2 min,98℃变性10 s,68℃退火和延伸1 min,共30个循环,最后再延伸7 min。PCR扩增产物经胶回收试剂盒纯化后,用BamH I、Sal I双酶切,与经同样酶切处理的pVITRO载体按10∶1连接、转化DH5α感受态菌株中,次日挑取菌落抽提质粒酶切鉴定正确后送公司测序。

1.4 pVIT RO/CD8α转染 SP2/0 细胞

无菌条件下抽提pVIT RO/CD8α质粒。按照脂质体试剂盒说明书操作,具体过程为:取对数期的SP2/0细胞用无血清培养液洗2次,于24孔板中每孔加入5×105个细胞,每孔500 μ L体系,共10孔。取8 μ g的质粒用无血清的培养液稀释至总量500 μ L,取20 μ L的脂质体用无血清培养液稀释至总量500 μ L,两者混合,微混匀,室温孵育20 min,每孔加入100 μ L的复合物。37℃6 h后更换含10%小牛血清的RMI 1640培养基,48 h后弃上清,收集细胞用于检测转基因的表达。

1.5 流式细胞仪检测CD8α的表达率

取pVITRO/CD8α质粒转染的SP2/0细胞2×105,PBS洗涤。用PE标记的CD8α单抗4℃孵育15 min,PBS洗1次后,用流式细胞仪(FACSCalibur)检测。

1.6 共聚焦显微镜检测CD8α在SP2/0细胞中的定位

取pVITRO/CD8α质粒转染的SP2/0细胞2×105,用FITC标记的CD8α单抗4℃孵育15 min,PBS洗涤,4%的多聚甲醛室温固定20 min,用PBS洗 1遍,然后加 200 μ L的PBS 重悬细胞,按1∶1 000加Honest室温5 min染核,再用PBS洗1遍,最后用10 μ L的PBS重悬细胞,点在玻片上,自然晾干,用封片剂(90%甘油,10%PBS,pH8.0)封片后置激光共聚焦显微镜下观察。

2 结 果

2.1 流式细胞仪检测磁珠分选的CD8α+T细胞的纯度

经磁珠分选的CD8α+T细胞用PE-CD8α单抗标记后,显示CD8α+T细胞的纯度为97%(图1),可用于下步提取总RNA。

图1 流式细胞仪检测磁珠分选的CD8α+T细胞纯度

2.2 获得CD8αcDNA 的PCR产物

经过CD8α+T细胞总 RNA的抽提,逆转录及PCR反应,获得了CD8αcDNA的产物,片段大小为750 bp左右,与理论设计的核苷酸片段大小相符(图2)。

图2 CD8αcDNA 的PCR产物

2.3 重组载体的鉴定

pVITRO/CD8α的重组质粒经双酶切鉴定后,显示约6 300 bp和750 bp左右的片段(图3)。对重组质粒插入序列进行测序分析,Genebank比对后显示为CD8α的cDNA序列。结果表明,CD8α已成功地克隆入真核表达载体中。

图 3 pVITRO/CD8α双酶切结果

2.4 CD8α在SP2/0细胞的表达

转染 pVITRO/CD8α的 SP2/0细胞经 PECD8α的单抗标记后用流式细胞仪检测,显示CD8α的表达率为61%(图4)。结果表明,CD8α能在SP2/0细胞中成功表达。

2.5 共聚焦显微镜检测CD8α在SP2/0细胞中的定位

转染 pVITRO/CD8α的 SP2/0细胞经 FITCCD8α单抗标记后,置于共聚焦显微镜下观察,结果显示CD8α主要在SP2/0细胞的细胞膜上表达(图5)。

图4 流式细胞仪检测CD8α在SP2/0细胞中的表达率

图5 共聚焦显微镜检测CD8α在SP2/0细胞中的定位

3 讨 论

IKDC是最近发现的一类既与树突状细胞(dendritic cell,DC)相似又与NK细胞相似的多功能嵌合细胞[6-7]。兼具NK细胞和DC的功能:与NK细胞类似,可以产生IFN-γ并通过膜表面活化性受体NKG2D直接杀伤靶细胞;在CpG的刺激下,IKDC杀伤功能减弱,但MHCⅡ类分子和共刺激分子的表达增强,从而获得了与DC类似的抗原提呈功能。IKDC能特异性的杀伤肿瘤细胞并且能交叉提呈肿瘤抗原,在肿瘤的免疫治疗中具有良好的应用前景。但IKDC在小鼠体内的含量极少,只占脾脏CD11c+细胞的1%～2%(约5 000个)和骨髓CD11c+细胞的 2%[8],远远不能满足过继免疫治疗所需的细胞数。目前体外用可溶性细胞因子IL-15刺激骨髓来源的DC可使IKDC得到一定的扩增,但扩增的效率比较低(仅能出现10～30倍的数量增长)[9-10]。已有的研究表明,IL-15处于细胞膜上比其可溶状态能更有力刺激NK细胞的生长:可溶性IL-15刺激只能使NK细胞扩增数十倍,而如果将IL-15基因与跨膜蛋白CD8 α基因融合,使IL-15表达在K562细胞的表面(膜型IL-15),用该刺激细胞可使NK细胞得到大量的扩增。因此,对可溶性IL-15进行改造,使其变为膜表达型IL-15,很有可能达到体外高效扩增IKDC的目的。本研究成功构建了含CD8α全长基因的表达载体,并证实其在SP2/0细胞的细胞膜上能得到高效表达,为进一步构建IL-15基因与CD8α基因的嵌合体,获得膜表达型的IL-15提供了依据。

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