规模化鸡场大肠杆菌的分离与药敏试验

张 宁 李贺侠 （安徽省和县畜牧兽医局 安徽和县 238200）

规模化鸡场大肠杆菌的分离与药敏试验

张 宁 李贺侠 （安徽省和县畜牧兽医局 安徽和县 238200）

对某规模化鸡场发生的疾病进行调查，根据临床症状、病理变化将疑似大肠杆菌病20份病鸡的肝脏样品经细菌培养、镜检和生化试验等实验室方法分离鉴定出18株大肠杆菌。动物实验表明所分离的大肠杆菌均具有很强的致病性。用临床上常用的9种抗菌药物对分离菌株进行药敏试验，结果表明，所分离的大肠杆菌对阿莫西林、丁胺卡那霉素、氟苯尼考和头孢噻呋高度敏感，对庆大霉素中度敏感，对青霉素、红霉素、恩诺沙星和链霉素等产生耐药性。

鸡 大肠杆菌 分离鉴定 药敏试验

鸡的大肠杆菌病是由大肠杆菌中的某些致病菌株引起的一类疾病的总称，各品种和年龄的鸡均可发生。本病一年四季均可发生，但以冬春和气温多变季节多发，常与慢性呼吸道病、新城疫等病混合感染，同时也与饲养管理、营养和应激等因素密切相关。近年来，随着我县养鸡业的日益发展和集约化程度的提高，本病也是我县养鸡业发病率较高、危害较为严重的疾病之一。大肠杆菌对药物极易产生抗药性，因此应在感染早期对分离出的大肠杆菌进行药敏试验，选择对禽大肠杆菌病最敏感有效的或选用本场过去少用的药物全群给药。

本试验首先根据病死鸡的临床症状和病理变化等作出初步诊断，并通过实验室检查确诊。通过药物敏感试验选择对大肠杆菌敏感的药物，提出治疗方案，推荐给广大养殖户，以减少大肠杆菌病带来的经济损失。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

2010年11月采自某规模化鸡场20份病死鸡的肝脏。

1.1.2 仪器与试剂

阿莫西林、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、头孢噻呋、庆大霉素、青霉素、红霉素、恩诺沙星和链霉素药敏纸片均由杭州微生物制品有限公司生产。麦康凯培养基、革兰氏染色液、高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、显微镜、冰箱和常用玻璃仪器等均由和县畜牧兽医局实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 染色镜检

无菌操作采集病死鸡的肝脏组织，涂片进行革兰氏染色，镜检。

1.2.2 细菌分离培养和形态学观察

无菌操作取病死鸡的肝脏组织分别接种于普通琼脂和麦糠凯琼脂培养基上，37℃培养24h，挑取培养基上的独立单在的菌落接种于LB液体培养基，37℃培养24h后，分别取上述菌落涂片，革兰氏染色镜检，在油镜下观察细菌的形态及染色特性。观察是否存在杂菌。对于已经纯化的细菌进行冷冻保存，未纯化的重复划平板，镜检，直至纯化为止。

1.2.3 生化试验

自制各种糖发酵管，取纯培养物分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇等生化管中，置于37℃恒温培养箱中，培养18～24h，观察发酵管的反应情况。按文献[1]要求自制各种生化试剂，取纯培养物分别做M.R.试验、V-P试验、硫化氢试验和靛基质试验。

1.2.4 动物实验

190 只健康30日龄雏鸡随机分为19组，每组10只，第1组至第18组为实验组，分别腹腔接种分离的18株大肠杆菌肉汤培养物，每只0.2mL，第19组为对照组，常规饲养。观察发病情况，于雏鸡死后，剖检观察病理变化，并且无菌操作采心血涂片，革兰氏染色，镜检。

1.2.5 药敏试验

对分离到的18株菌株进行了药敏试验，共检测9种药物，包括阿莫西林、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、头孢噻呋、庆大霉素、青霉素、红霉素、恩诺沙星和链霉素。根据NCCLS标准[2]判定结果。

2 结果

2.1 剖检变化

经剖检可见：病死鸡剖检均发现以肝周炎、心包炎变化为主，即俗称“包心包肝”。特异性恶臭味，腹腔有积液，呈浅黄色。

2.2 染色镜检结果

肝脏涂片革兰氏染色镜检，均为阴性小杆菌，单个散在，两端钝圆，表面光滑湿润，两极着色较深，边缘整齐的小菌群。符合大肠杆菌的形态特征[3]，结合临床症状和病理变化，初步判断为大肠杆菌感染。

2.3 细菌分离

分离菌经37℃培养24h，在麦糠凯琼脂上形成红色、圆形、隆起、光滑湿润及边缘整齐的中等大菌落，在普通琼脂斜面上为灰白色菌落，培养物涂片，革兰氏染色，镜检，可见到革兰氏阴性、两端钝圆的小杆菌。

2.4 生化试验结果

各分离菌株均能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖和甘露醇，产酸产气；能产生靛基质，不产生硫化氢；M.R.试验为阳性，V-P试验为阴性。试验结果符合大肠杆菌的生化特征。

2.5 动物试验结果

对照组10只仔鸡存活，无临床症状。攻毒组接种后12h开始发病，24h后全部发病，于72h陆续死亡。死前症状为精神沉郁，食欲不振，腹泻，拉黄白稀粪，离群呆立，昏睡，符合鸡大肠杆菌病的临床症状。死后剖检可见大肠杆菌典型病变，无菌操作取发病鸡的肝脏涂片、染色和镜检，镜下观察可见两端钝圆的短小杆菌，单个或成对存在，两极着色较深，革兰氏染色阴性。生化试验结果同2.4，从而证明，动物实验的仔鸡被大肠杆菌感染。

2.6 药敏试验

测量药敏纸法的抑菌圈直径，取平均值的结果见表1。结果表明，所分离大肠杆菌对阿莫西林、丁胺卡那霉素、氟苯尼考和头孢噻呋高度敏感，对庆大霉素中度敏感，对青霉素、红霉素、恩诺沙星和链霉素等产生耐药性。

3 讨论

本次试验分离的18株细菌的革兰氏染色涂片细菌的形态皆与鸡大肠杆菌的形态特征一致，18株细菌的生化试验结果一致，且与鸡大肠杆菌的生化特征一致，可断定这些菌株属于大肠杆菌。

表1 分离细菌的药敏试验结果

从本次的药敏试验结果可以看出，该批大肠杆菌分离株对阿莫西林、丁胺卡那霉素、氟苯尼考和头孢噻呋高度敏感，对庆大霉素中度敏感，对青霉素、红霉素、恩诺沙星和链霉素等产生耐药性。建议各养殖场治疗鸡大肠杆菌病时，临床上应严格掌握抗菌药物的适当使用，防止错用、滥用抗菌药，最好先做药敏试验，选出敏感药物进行有效治疗，结合药敏试验结果考虑联合用药和交替用药。投药与应用大肠杆菌多价疫苗相结合，尽量减少损失。

大肠杆菌是一种条件致病菌，常在一定条件下转变为致病病原，如：饲养管理不当、环境较差或家禽的抵抗力低等情况下，家禽机体受到侵害引发大肠杆菌病。所以，对于鸡场大肠杆菌病的防治不能仅仅依靠药物，应采取综合防制措施，建立规模化鸡场生物安全体系，最大可能地减少鸡场内的病原微生物，降低鸡场病原感染几率，从而促进养鸡业的健康发展。

[1]姚火春．兽医微生物实验指导[M].中国农业出版社，2002,36-42．

[2]王辉，陈民钧，徐英春．简要介绍美国NCCLS药敏试验纸片扩散法法规(续)[J]．中华医学检验杂志，1995，18(2)：118-124．

[3]陆承平主编．兽医微生物学[M]（第三版）.北京：中国农业出版社，200l，217．

[4]魏蕻,朱晓霞,邓一科,等.鸡源大肠杆菌分离鉴定与药敏试验[J].西南民族大学学报．自然科学版,2009,5（35）：1020-1023.

S859.7

A

1008-3847（2011）06-0040-02

*通讯作者：张宁（1981-），安徽蒙城人，主要从事动物卫生监督工作。

联系方式：li-hexia@163.com

丁焕中