正交试验优选天麻的提取工艺

张 震,张长林

(1.山东省药学会,山东济南 250101;2.山东中医药大学附属医院,山东济南 250014)

天麻为兰科植物天麻 Gastrodia elataBL.的干燥块茎。具有息风止痉,平抑肝阳,祛风通络的功能。天麻中含有天麻素(gastrodin即天麻苷),对羟基苯甲醇,β-谷甾醇,萝卜苷,柠檬酸,柠檬酸单甲酯,棕榈酸,对羟基苯甲醛,香荚兰醛(香荚兰素),香荚兰醇等。其中天麻素为 4-羟甲基苯 -β -D-葡萄砒喃糖苷,具有镇静、麻醉、抗惊厥的作用,为天麻的主要活性成分[1～4]。香荚兰素、香荚兰醇亦有镇静、抗惊厥的作用[1]。本研究采用正交试验,天麻素的提取率、出膏率为考察指标,对乙醇浓度、加醇量、提取次数进行了优选,确定天麻的适宜提取工艺。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪 (美国Waters公司),检测器为Waters 2487二级管阵列检测器,泵 Waters 600,控制器为 Waters 600,数据处理器为LC系统化学工作站。天麻素对照品购于中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号为 110807-200205。天麻药材采购于济南市建联药材公司,由山东省中医药研究院钟方晓研究员鉴定为兰科植物天麻 Gastrodia elata BL.的干燥块茎,粉碎为小块备用。所用试剂乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计 对乙醇浓度、加乙醇量、提取次数三因素进行考察,因素水平设计见表 1。采用 L9(34)正交试验表安排试验。每次试验各取天麻药材 8 g,精密称定,回流提取,滤过,分别以相应浓度的乙醇定容至 250 mL量瓶中。

表1 因素水平

2.2 出膏率测定 分别精密量取各份提取液 50 mL,平行取2份,置已恒重的蒸发皿中,蒸干后,105℃干燥 3 h,冷却后称重,计算出膏率。

2.3 色谱条件 流动相:乙腈 -0.05%磷酸 (3∶97);流速:1 mL·min-1;检测波长:220 nm;进样量:10μL;柱温:室温。天麻药材提取液及对照品的HPLC色谱图见图 1。

2.4 对照品溶液制备 精密称取天麻素对照品 8.24 mg,置25 mL量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,浓度为0.329 6 mg·mL-1,作为对照品贮备液。精密吸取 2 mL于10 mL量瓶中,加流动相至刻度,摇匀,作为对照品溶液,浓度为 65.92μg·mL-1。

图1 HPLC图谱A对照品、B天麻药材

2.5 天麻药材溶液的制备 取天麻,粉碎,取粉末 (过 4号筛)约 0.8 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入 60%乙醇50 mL,称定重量,加热回流提取 3 h,放冷再称定重量,滤过,取续滤液 10 mL,浓缩至近干,残渣加乙腈 -水 (3∶97)混合液溶解,转移至 10 mL量瓶中,并用乙腈 -水 (3∶97)混合溶液稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.6 供试品溶液的制备 精密吸取各份天麻药材提取液 10 mL,水浴蒸干,以乙腈 -水(3∶97)混合液溶解,转移至 25 mL的量瓶中,加乙腈 -水(3∶97)至刻度,摇匀,以 0.45μm的滤膜滤过,作为供试品溶液。

2.7 线性关系考察 精密吸取上述对照品贮备液 0.5、1、2、3、4 mL于 10 mL量瓶中,加流动相至刻度摇匀,即得。分别进样 10μL,按上述色谱条件,测定峰面积积分值,对所得数据进行回归分析,回归方程为 Y=970 5X-153.05,r=0. 999 6。结果表明天麻素进样量在 0.164 8～1.318μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.8 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液 10μL,连续进样 5次,测定峰面积积分值,结果 RSD为 0.84%。

2.9 稳定性试验 将同一供试品溶液放置 0、2、4、6、8 h,按照上述色谱条件,进样 10μL进行测定,记录峰面积积分值,结果 RSD为 1.06%,表明供试液 8 h内稳定。

2.10 重复性试验 取正交试验的 1号试验液,按照供试品溶液的制备方法,进行 6份平行试验,并计算 1号试验液中天麻素的含量,结果 RSD为 1.30%。

2.11 加样回收率试验 精密吸取 1号试验液 5 mL,分别精密加入天麻素对照品 0.126 mg,按照供试品溶液的制备方法,制备回收率试验液,依法进行测定,计算平均回收率为98.68%,RSD为 0.907%,结果见表 2。

表2 回收率试验结果

2.12 正交试验结果及方差分析 取各供试品溶液 10μL注入液相色谱仪,依法进行测定,计算各试验样品天麻素的转移率,结果见表 3,方差分析见表 4。

表3 正交试验结果

表4 方差分析

试验结果直观分析可见,各因素对天麻素的提取率稍有差异,C＞B＞A,A对出膏率影响为主要因素,C、B对出膏率影响为次要因素;方差分析统计表明 A、B、C三因素对天麻素提取率的影响均不显著,A对出膏率的影响显著,且以A1为最佳,综合天麻素提取率及出膏率及生产成本,选择A1B1C1,即以 60%的乙醇,回流提取 2次,每次加入 6倍量。2.13 工艺验证 取 3份天麻药材,每份 8 g,精密称定,分别加入 60%乙醇,回流提取 2次,每次加入6倍量乙醇,同上操作,测定天麻素的提取率及出膏率,结果见表 5。

表5 工艺验证结果

工艺验证结果表明,通过正交试验设计得到的天麻提取工艺天麻素的提取率较高、工艺稳定、科学合理。因此,确定天麻的提取工艺为 60%的乙醇,加入6倍量,回流提取2次,每次 2 h。

3 讨论

本实验采用不同浓度的乙醇提取后直接取样测定,考察了乙醇浓度、提取次数、加乙醇量对天麻素提取率的影响,至于浓缩、干燥方式对浸膏中天麻素含量的影响有待研究。

本实验采用 HPLC法测定天麻提取液中天麻素的含量,方法学考察表明天麻素分离良好,进样量在 0.164 8～1.318 μg范围内与峰面积呈良好线性关系,平均回收率为98.68%,RSD为 0.907%。

[1] 阴健,郭力弓.中药现代研究与临床应用Ⅰ[M].北京:学苑出版社,1993:140.

[2] 国家医药管理局中草药情报中心站.植物药有效成分手册[M].北京:人民卫生出版社,1986:486.

[3] 尚伟芬,于澍仁.天麻药理作用研究进展[J].中草药, 1997,28(10):629-632.

[4] 杨世林,兰进,徐锦堂.天麻的研究进展[J].中草药, 1999,31(1):66-69.