依达拉奉对AD模型大鼠行为学和脑部NOS1阳性神经元的影响

李 雷 辛 勤 李海军 于 婷 徐旭东 (济宁医学院，山东 济宁 272029)

依达拉奉对AD模型大鼠行为学和脑部NOS1阳性神经元的影响

李 雷 辛 勤 李海军 于 婷1徐旭东 (济宁医学院，山东 济宁 272029)

目的 观察依达拉奉注射液对老年性痴呆(AD)模型大鼠学习记忆功能和神经元性一氧化氮合酶(NOS1)阳性神经元的影响。方法用腹腔注射(ip)D-半乳糖和灌胃注射(ig)AlCl3法建立AD模型，Morris水迷宫实验检测学习记忆能力，以免疫组化法观察大鼠脑部的NOS1变化。结果 依达拉奉能显著改善AD模型大鼠的学习记忆障碍(P＜0.05)，并明显增强大脑皮质和海马NOS1活性及其神经元密度(P＜0.05)，其作用呈现出一定的量效关系。结论 中枢NOS1活性与学习记忆成绩显著相关;依达拉奉注射液对AD模型的学习记忆障碍有明显的改善作用。

阿尔茨海默病;依达拉奉;实验研究

阿尔茨海默病(AD)患者老年斑周围的星形胶质细胞表达神经元性一氧化氮合酶(NOS1)增多;而额叶、海马等脑区NOS1mRNA阳性神经元明显减少〔1〕;由于胶质细胞产生大量NO，破坏胆碱能神经元，使额叶、海马等脑区NOS1神经元受损，最终导致AD患者出现学习记忆障碍和痴呆等病症〔2〕。老年性痴呆与脑细胞长期缺血缺氧有关，研究证明与自由基损伤、细胞因子等有一定关系〔1〕。本实验拟研究依达拉奉注射液对AD大鼠进行药物干预，观测行为学改变以及对AD大鼠脑部NOS1变化的影响，以探讨依达拉奉注射液对AD可能的防治作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 雄性健康Wistar大鼠50只，鼠龄16周龄，体重220～340 g，山东新华抗生素厂提供，合格证号:SCXK鲁20050017，使用证号:SYSK鲁20050047。实验动物饲以标准颗粒饲料，分笼喂养，自由饮食，自然昼夜光线照明，实验室内通风良好，温度18℃ ～25℃，相对湿度为40% ～70%。

1.1.2 试剂 AlCl3(天津市双船化学试剂)，D-半乳糖(天津灏洋生物制品有限公司)，兔抗大鼠NOS1(武汉博士德生物工程有限公司)，nNOS试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.1.3 仪器 PCR扩增自动循环仪(Perlin Elmer Cetus 9700，美国)，TD-300病理组织图像分析系统(北京天地公司)，Morris水迷宫、视频采集系统(中国科学院技术研究所)。

1.2 动物分组 大鼠适应性饲养1 w后，经Morris水迷宫测试，超过2 min未找到安全平台淘汰6只，剩余44只，随机分为空白对照组12只，造模组12只，依达拉奉低剂量组10只(低量剂组)，依达拉奉高剂量组10只(高剂量组)。实验后造模组死亡2只，低剂组死亡1只，高剂组死亡2只。

1.3 AD动物模型的建立和给药〔3〕造模组，低剂组和高剂组腹腔注射(ip)D-半乳糖60 mg·kg－1·d－1(生理盐水配制)和灌胃注射(ig)AlCl3100 mg·kg－1·d－1(双蒸水配制)，连续12 w;空白对照组ip等量的生理盐水和ig等量的双蒸水。从实验开始第9周，低剂组和高剂组分别于大鼠尾静脉注射依达拉奉3和6 mg·kg－1·d－1，造模组和空白对照组分别注射等量生理盐水。每日上午给药，实验共12 w。12 w后，采用Morris水迷宫法测试学习记忆能力。

1.4 行为学测试 大鼠学习、记忆测验参照Morris迷宫箱进行测试所有大鼠在脑内注射后进行Morris水迷宫测试。测试程序包括:①空间探索试验:历时5 d，每天上下午各4次，将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录其在2 min内寻找到平台的时间(逃避潜伏期)。如果大鼠在2 min未找到平台，则由实验者用手牵引其至平台上，让大鼠停留10 s，再放回笼中。②定位航行试验:第6天撤除平台，将大鼠任选1个入水点放入水中，记录其2 min的游泳轨迹，分别计算其跨越各象限内的游泳距离以及在原平台象限游泳的时间和距离占整个游泳时间和距离的百分比。

1.5 标本的采集和处理 所有大鼠饲养3个月，经行为学测试后处死，大鼠经3%戊巴比妥(50mg/kg)麻醉后，剪开胸骨暴露心脏，经左心室插管进入升主动脉，同时剪开右心房放血;先快速以生理盐水100 ml左右进行预冲洗，随即灌注4℃预冷的含4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)，灌注约30 min。然后断头取脑，大脑组织放入10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋切片用于NOS1的测定。

1.6 免疫组化 按试剂盒说明书操作。每块玻片中NOS1阳性神经元数量，用TD-300图像分析系统对NOS1阳性神经元进行处理，分析其阳性细胞数及细胞面积(反映细胞大小)，取其平均值作为该玻片的数据。灰度值大小与NOS1的表达强度成反比，即灰度值越小表示NOS1表达越强，反之越弱。

1.7 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件，数据用±s表示。对Morris水迷宫数据采用t检验。对免疫组化结果采用SNK分析，即q检验，均满足正态分布和方差齐性条件。多个样本均数比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，均数间两两比较采Student-Newman-Keuls检验。

2 结果

2.1 逃避潜伏期 各组大鼠均随着训练天数的增加，逃避潜伏期越来越短，表明各组大鼠学习寻找平台的能力在历次的学习训练中均得到提高，第1天各组无统计学差异(P=0.80)，第2～5天各组出现统计学差异(P分别为0.027，0.019，4.1×10－4，0.03)。两两比较发现:第2天到第5天造模组大鼠的逃避潜伏期较对照组明显延长(P＜0.05或P＜0.01)，显现出学习记忆力明显减退;与造模组比较，用药组逃避潜伏期明显缩短，其中以高剂量组较明显(第4天Q值为7.422 7，P＜0.05，第5天的Q值为3.059 1，P＜0.01)，低剂量组次之(第4天和第5天的Q值为6.763 6，3.908 8，P＜0.05)，显现出学习记忆能力明显提高;用药组组间比较，高剂量组对低剂量组逃避潜伏期有不同程度的缩短，但差别无显著差异(第4天和第5天的 Q值为0.850 5，0.709 9，P ＞0.05)。见表1。

表1 大鼠5 d逃避潜伏期的变化(±s，s)

表1 大鼠5 d逃避潜伏期的变化(±s，s)

与对照组比较:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;与造模组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01

组别 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天5±3.4造模组 10 91.2±21.6 86.5±25.41) 51.2±25.81) 47.7±8.62) 31.7±29.32)低剂量组 9 83.2±15.7 72.1±33.6 47.3±18.5 28.9±11.54) 25.6±14.83)高剂量组 8 82.2±19.7 68.7±36.5 48.1±22.6 26.4±13.34) 21.5±15.13)对照组 12 86.3±26.3 48.6±17.4 21.1±14.6 12.7±4.6 8.

2.2 大鼠空间探索实验所反映记忆能力的变化 各组大鼠在各象限跨越各相应平台次数的结果。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限各组之间比较均有统计学意义(P值分别为1.3×10－7，0.045，4.1×10－11)，Ⅲ象限各组比较无显著差异(P=0.331)。各组两两比较:造模组大鼠与对照组比较，在Ⅰ(Q=9.360 8，P＜0.01)和Ⅳ(Q=11.438 0，P＜0.01)象限跨越各相应平台次数明显减少;与造模组比较，各用药组在各象限跨越各相应平台次数不同程度增多，其中以高剂量组明显，特别是在Ⅰ(Q=6.217 7，P＜0.01)和Ⅳ象限更多(Q=5.921 6，P＜0.01)。见表2。

表2 大鼠至各象限跨越原平台的次数(±s，次)

表2 大鼠至各象限跨越原平台的次数(±s，次)

与对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与造模组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01

组别 n Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ12 9.5±2.3 6.2±2.2 6.4±1.1 11.5±1.8造模组 10 4.2±1.32)3.8±1.51)5.1±2.4 4.7±1.82)低剂量组 9 5.8±2.13)5.5±3.43)6.6±2.6 6.8±2.73)高剂量组 8 8.1±1.44)6.7±1.53)5.4±2.3 8.6±1.34)对照组

2.3 免疫组织化学(SABC法)定性观察 皮质的各个区域均可见散在多极形NOS1阳性神经元，散见于Ⅱ层～Ⅳ层，细胞数以深层为多，阳性细胞带有3～5个突起。在皮质各区内可见中等密度的NOS1阳性纤维，纤维精细不等，相互编织成网。海马的锥体细胞不染色，齿状回门区可见一些大的中度染色细胞，海马和齿状回均可见阳性纤维，量较皮质略细而稀疏。大脑皮质和海马NOS1阳性反应以对照组最强，而造模组最弱，2个治疗组介于二者之间。见图1、图2。

2.4 大鼠脑NOS1活性的影响定量检测 大鼠脑NOS1活性在皮质和海马各组间均有显著差异(P分别为5.7×10－11和5.5×10－7)。造模组与对照组比较在皮层(Q=12.016 4)及海马CA1(Q=11.189 6)的NOS1阳性细胞数量均明显减少(P＜0.01)。在海马CA1区，低剂量组(Q=4.157 9)和高剂量组(Q=9.022 3)与造模组比较NOS1阳性细胞数量明显增加(P＜0.01);在皮质区，低剂量组和高剂量组相比无统计学意义(Q=0.929 8，P＞0.05)。在海马CA1区，低剂量组和高剂量组相比明显减少(Q=4.375 8，P＜0.05)。见表3。

表3 各组大鼠脑NOS1阳性细胞数及面积比较(±s，个/mm2)

表3 各组大鼠脑NOS1阳性细胞数及面积比较(±s，个/mm2)

组别 n 皮层NOS1阳性细胞数 海马CA1区NOS1阳性细胞12 11.97±2.35 10.35±2.17造模组 10 4.34±1.71 3.98±2.15低剂量组 9 7.76±2.68 6.52±1.36高剂量组数对照组8 7.43±1.16 8.67±1.49

图1 大鼠皮质额叶NOS1阳性神经元(×400)

图2 大鼠海马CA1区NOS1阳性神经元(×400)

3 讨论

一氧化氮(NO)作为中枢神经系统(CNS)细胞间信使分子，在学习记忆机制中具有重要作用。NO在中枢神经系统突触可塑性中起重要作用。NO供体物质可加强培养的海马锥体细胞递质释放，而NOS抑制剂或血红蛋白则可阻断海马CA1区中的长时程增强(LTP)，说明在LTP中NO充当逆行递质作用。一氧化氮合酶(NOS)是催化产生内源性NO的唯一酶类，并因NO的非囊泡释放、高度弥散和半衰期极短等特征而在很大程度上决定着NO的生物学效应。目前已知CNS中至少存在两类 NOS〔4〕:原生型 NOS(cNOS)及诱导型 NOS(iNOS)。cNOS包括神经元型 NOS(nNOS，即 NOS1)和内皮型 NOS(eNOS)。它们分别执行不同的生理和病理功能，其中nNOS可能是参与学习记忆机制的关键酶。研究表明〔5〕，动物学习记忆过程中，不同脑区的NO水平及NOS活性增高。学习过程伴有海马NOS1合成及活性增加，NOS1/NO在学习记忆的获得阶段具有重要作用。检测NOS1对研究AD病情的进展有重要意义。

理想的AD动物模型应是能够客观、全面地再现AD患者的临床症状和病理变化，能够详尽地评价神经病理、神经化学和行为各个方面;另外，还要适用于探讨中药多靶点作用机制及有效药物筛选。AD是发病率最高的中枢神经系统退变性疾病，主要表现为学习记忆能力的减退和分析、综合、理解、判断能力下降，尤以近事遗忘为主〔6〕。从智力测试实验结果我们得知:在Morris水迷宫定位航行实验中，造模组大鼠每天逃避潜伏期都明显延长，在空间探索实验中，在各象限跨越相应平台次数明显减少，说明造模组大脑学习记忆能力严重受损，明显下降，提示该次自制AD大鼠模型具有学习记忆和空间探索能力下降的特点，与AD临床表现极其相似，证明了该次AD大鼠模型造模成功。

依达拉奉可以清除体内活性氧分子、抑制脂质过氧化，抑制血管内皮细胞的损害，抑制脑水肿、改善神经症状，抑制迟发性神经细胞死亡等，既能对抗氧自由基增强中枢神经耐缺氧能力，又能减轻脑水肿，降低颅内压〔7〕。从而改善脑部缺氧缺血状况，对痴呆症有良好的治疗效果。笔者认为依达拉奉注射液治疗AD的临床价值在于扩张血管减轻外周阻力，改善动静脉血供，使脑组织内葡萄糖和氧得到充分利用，提高了大脑所需能量，刺激脑内很多神经递质及相关酶的活性，从而改善大脑功能和加强了语言、记忆、情绪等的能力。

本试验结果表明依达拉奉注射液对痴呆大鼠的信息获取能力和信息贮存能力都有明显的改善作用，能抑制模型大鼠海马NOS1神经元受损。证实依达拉奉可有效改善AD的病理过程，其作用呈现出一定的量效关系。提示依达拉奉治疗AD可通过多系统、多层次作用机制而发挥功效，其具体机制有待进一步探讨。

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R749.16

A

1005-9202(2011)12-2279-03

1 济宁市第一人民医院

于 婷(1981-)，女，硕士，主治医师，主要从事细胞生物学研究。

李 雷(1979-)，男，硕士，讲师，主要从事神经内科临床工作及诊断学研究。

〔2009-12-14收稿 2010-04-19修回〕

(编辑 张永贵/曹梦园)