维药鹰嘴豆中金属硫蛋白提取液对肿瘤细胞的抑制作用

于立博 龚建福 刘继文 (新疆医科大学公共卫生学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

维药鹰嘴豆中金属硫蛋白提取液对肿瘤细胞的抑制作用

于立博 龚建福 刘继文 (新疆医科大学公共卫生学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

目的 研究鹰嘴豆金属硫蛋白(MT)体外抑制肿瘤的效果。方法 将人肺癌细胞株(A549)、人胃癌细胞株(MGC-803)、人乳腺癌细胞株(Bcap-37)进行传代培养，将提取的鹰嘴豆MT配制成5个浓度组:0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 5、0.000 1 g/ml，空白对照组和本底对照组。观察肿瘤细胞的抑制率和凋亡率。结果 与空白对照组比较，0.010 0、0.005 0、0.001 0 g/ml三个浓度组的肿瘤抑制率和细胞凋亡率均增加。结论鹰嘴豆MT可抑制肿瘤细胞增长，促进肿瘤细胞凋亡。

肿瘤细胞;体外培养;鹰嘴豆金属硫蛋白

金属硫蛋白(MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。1957年Margoshes和Valles在研究镉的生物学作用时，分离出该物质。MT具有广泛的生理功能，MT的应用研究已成为一个新热点，其中MT与肿瘤的关系，其在肿瘤细胞中的表达规律及其在肿瘤治疗中的应用已经成为该领域研究的焦点。目前研究发现几乎所有动植物组织(哺乳动物结缔组织除外)、原核、真核微生物中均能分离出MT。本实验主要观察维药鹰嘴豆中植物MT提取液体外抑制肿瘤的作用，为今后的药食兼用植物开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 灭菌胎牛血清(FBS，500 ml，Gibco，批号:05030313L6)，DMEM 粉(Gibco，批号:12100-046)，胰蛋白酶(美国，DIFCO Laboratories)，酶联免疫检测仪(美国Bio-RAD公司，∑960)。流式细胞仪(美国Becton-Dickinson，型号:FACSVantageSE)。

1.2 鹰嘴豆MT制备 新疆木垒县当年产鹰嘴豆，由新疆农科院种子供应站提供。将鹰嘴豆种子风干磨碎过80目筛，加入0.1 mol/L，pH8.6的Tris-HCl缓冲液后采用超声充分破碎，后于4℃冰箱过夜抽提。于4℃抽提，10 000 r/min离心30 min，收集上清液。上清液于100℃水浴加热2～3 min，后于4℃下10 000 r/min离心20 min。收集上清液，加入3倍体积的－20℃的预冷无水乙醇，过夜沉淀后，于4℃下12 000 r/min离心20 min。取沉淀加入5ml0.01mol/L Tris-HCl缓冲液溶解数小时，然后在4℃下15 000 r/min离心20 min，收集上清液即MT提取液，将以上提取液于－20℃下冷冻30 h后，放入冷冻干燥机制成冻干粉备用。

1.3 受试细胞培养 人肺癌细胞株(A549)、人胃癌细胞株(MGC-803)、人乳腺癌细胞株(Bcap-37)均由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供。将A549、MGC-803、Bcap-37常规培养于25 cm培养瓶中，每2～3 d换1次液，每2～3 d传代1次。

1.4 鹰嘴豆MT体外抑瘤实验 实验组分为0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 5、0.000 1 g/ml 5 个浓度组(用 5%DMEM培养液溶解MT冻干粉配制)、空白对照组(含同一细胞密度的培养液)和本底对照组(等体积含相应浓度的MT冻干粉的无细胞培养液)。取处于对数生长期、状态良好的细胞进行酶联免疫检测，细胞生长抑制率=〔(空白对照组A均值-实验组A均值)/空白对照组A均值〕×100%。同时取以上对数期细胞分别用0.25%胰蛋白酶消化传代后待细胞长到70%～80%满度时，用移液枪小心吸弃旧培养液，加入含有不同浓度受试物(浓度为0.01，0.005 g/ml)的培养液继续培养24 h，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2 结果

2.1 细胞活力测定结果 对于Bcap-37细胞株，当MT浓度分别为:0.000 1、0.000 5、0.001 0、0.005 0、0.010 0 g/ml时，各浓度组的A值均明显低于空白对照组(P＜0.05);对于A549细胞株，当受试物浓度分别为:0.001 0、0.005 0、0.010 0 g/ml时，各浓度组的A值均显著低于空白对照组(P＜0.05)，而0.000 1与0.000 5 g/ml浓度组的A值与空白对照组比较无显著差异(P＞0.05);对 MGC-803细胞株，受试物浓度为:0.000 5、0.001 0、0.005 0、0.010 0 g/ml时，各浓度组A值明显低于空白对照组(P＜0.05)，而浓度为0.000 1 g/m l组的A值与空白对照组比较无显著差异(P＞0.05)。见表1。

2.2 细胞凋亡情况的测定 用AV(AnnexinⅤ-FITC)和碘化丙啶(PI)双染 A549、MGC-803、Bcap-37，通过流式细胞仪测定细胞凋亡情况，见表2和图1。用0.010 0和0.005 0 g/ml鹰嘴豆MT干预24 h后，三种癌细胞的凋亡率均明显高于空白对照组(P＜0.01)，其中干预效果最好的是MGC-803，凋亡率达到了28.60%，说明胃癌MGC-803细胞对受试物更敏感。

表1 鹰嘴豆MT对肿瘤细胞生长的影响(±s)

表1 鹰嘴豆MT对肿瘤细胞生长的影响(±s)

与空白对照组比较:1)P＜0.05，下表同

组别(g/ml) A值抑制率(%)Bcap-37 A549 MGC-803空白对照组Bcap-37 A549 MGC-803 0.445±0.038 0.376±0.019 23.34 3.68 5.05 0.407±0.018 0.462±0.025 0.396±0.041 － － －0.010 0 0.154±0.0251) 0.148±0.0101) 0.196±0.0231) 62.16 67.97 50.50 0.005 0 0.201±0.0111) 0.265±0.0181) 0.211±0.0251) 50.61 42.64 46.72 0.001 0 0.253±0.0281) 0.352±0.0631) 0.256±0.0251) 38.57 23.80 35.36 0.000 5 0.300±0.0581) 0.420±0.047 0.350±0.0161) 24.29 9.13 11.62 0.000 1 0.312±0.0211)

表2 鹰嘴豆MT对肿瘤细胞凋亡的影响(±s，%)

表2 鹰嘴豆MT对肿瘤细胞凋亡的影响(±s，%)

组别(g/ml)Bcap-37 A549 MGC-803空白对照组5.70±0.31 0.10±0.01 4.40±0.11 0.005 0 15.00±1.311) 20.50±1.21 14.06±1.241)0.010 0 22.70±1.231) 21.70±1.151) 28.60±1.451)

图1 不同浓度鹰嘴豆MT对Bcap-37、A549和MGC-803细胞凋亡的流式细胞术分析

3 讨论

MT是人体内重要的自由基清除剂，其清除自由基的能力是谷胱甘肽的800倍。哺乳动物细胞内自发性基因突变是导致内源性损伤最重要的原因，而基因突变是肿瘤发生的重要原因。肿瘤的发生是一个复杂的过程，既与细胞增殖过度有关，又与细胞凋亡不足有关〔2〕。本实验结果表明，鹰嘴豆MT具有显著抑制肿瘤细胞作用，且具有明显的剂量依赖性。除了极低浓度组对A549、MGC-803两种癌细胞未见抑制作用外，其他浓度组均有抑制作用，其中对Bcap-37和MGC-803的抑制作用较强，对A549细胞最高浓度(0.010 0 g/ml)具有较强的抑制效果，抑制率达到了67.97%。说明鹰嘴豆 MT对 Bcap-37和MGC-803细胞的抑制作用更敏感。通过流式细胞仪测定细胞凋亡情况，发现鹰嘴豆MT对3种瘤细胞的凋亡均有促进作用，其作用机制有待进一步阐明。

传统的放疗、化疗和生物治疗手段对肿瘤早期治疗效果显著，但是肿瘤一旦发生转移便会给治疗带来极大困难。化疗、放疗对肿瘤患者的体液免疫和细胞免疫功能都有不同程度的损害，肿瘤患者化、放疗后的NK细胞活性、免疫球蛋白水平以及T细胞总数都有明显下降，其中 CD8的值明显升高〔3〕。因此，寻找高效低毒的抗肿瘤物质仍是当前的主要研究方向。

本实验选用目前最常见3种癌细胞菌株作为受试物，观察鹰嘴豆MT的体外抑制肿瘤效果，虽然具有一定的代表性，但不是很全面，不能代表所有的肿瘤类型，所以在进一步的实验中应该对各种类型的癌细胞进行全面的实验，以期全面了解外源性植物MT对肿瘤的治疗效果，为今后MT的进一步开发利用提供理论依据。

1 包怡红，李锐达，梁 雪，等.乳清蛋白肽对衰老小鼠抗氧化能力的影响〔J〕.营养学报，2010;32(3):239-41.

2 彭新颜，孔保华，熊幼翎.乳清多肽对D-半乳糖衰老模型大鼠血清和脏器组织抗氧化效果的影响〔J〕.食品科学，2010;31(9):238-42.

3 彭新颜，孔保华，熊幼翎.乳清蛋白抗氧化肽对H2O2所致人胚肺成纤维细胞MRC-5过氧化损伤的保护作用〔J〕.中国农业科学，2010;43(14):2982-9.

R73

A

1005-9202(2011)12-2242-02

新疆维吾尔自治区教育厅重点项目(No.XJEDU2005I16)

于立博(1974-)，女，硕士，讲师，主要从事营养与疾病研究。

〔2011-01-13收稿 2011-04-08修回〕

(编辑 张 慧)