罗格列酮对THP-1源性泡沫细胞内胆固醇和氧化型低密度脂蛋白及丙二醛水平的影响

苟连平 吕 湛 胡厚祥 张 俊 罗 勇 冯 杰 蒲丽君

(川北医学院附属医院心内科，四川 南充 637000)

罗格列酮对THP-1源性泡沫细胞内胆固醇和氧化型低密度脂蛋白及丙二醛水平的影响

苟连平 吕 湛 胡厚祥 张 俊 罗 勇 冯 杰 蒲丽君

(川北医学院附属医院心内科，四川 南充 637000)

目的 观察罗格列酮干预THP-1源性泡沫细胞内胆固醇和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)及丙二醛(MDA)水平的变化及其防治动脉粥样硬化的可能机制。方法 培养THP-1细胞，佛波脂(PAM)使之巨噬化，ox-LDL使巨噬细胞形成泡沫细胞，罗格列酮和泡沫细胞孵育48 h。用荧光分光光度法检测细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)的含量;ELISA法测定ox-LDL;TBARS法检量MDA。结果 THP-1细胞经PAM和ox-LDL孵育后，有大量泡沫细胞形成。细胞内TC、FC、CE、ox-LDL、MDA均增多(P＜0.05);罗格列酮干预后，细胞内TC、FC、CE、ox-LDLD、MDA均显著减少(P＜0.05)。结论 罗格列酮可通过降低细胞内胆固醇的聚积和减轻细胞的氧化抗动脉粥样硬化。

罗格列酮;泡沫细胞;胆固醇;氧化型低密度脂蛋白;丙二醛

噻烷二唑酮类药物罗格列酮广泛用于糖尿病的治疗，也可防治动脉粥样硬化(AS)〔1〕。本课题研究罗格列酮对THP-1源性泡沫细胞内胆固醇(TC)、氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)及丙二醛(MDA)水平的影响，探讨罗格列酮防治AS更多新机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 RPMI-1640培养基，美国Gibco公司。新生小牛血清，成都哈里生物工程有限公司。THP-1单核细胞株，四川大学免疫教研室。佛波脂(PAM)、罗格列酮为美国Sigma公司。油红O，美国Amrcsco公司。BCA试剂盒，美国Pierce公司。MDA检测试剂盒，南京建成生物科技有限公司;ox-LDL试剂盒，上海锐聪实验室设备有限公司。Beckman Culture Optima L-100 XP型超速离心机，美国。HITACHI650-60荧光分光光度计，日本。

1.2 方法

1.2.1 LDL的分离提取、氧化修饰及泡沫细胞模型建立、鉴定健康人血浆来自本院体检健康者。①LDL的分离〔2〕:正常人新鲜血浆经密度梯度超速离心，分离LDL。②LDL的氧化修饰:将上述透析好的LDL置于15μmol/L CuSO4溶液中透析氧化24 h，0.45μm的微孔滤器过滤，并用BCA法测定其浓度。③泡沫细胞模型建立、鉴定:含10%新生小牛血清的RPMI-1640培养基THP-1细胞。2～3代的THP-1细胞于含PAM 160 nmol/L，0.3%BSA的无血清培养基中培养72 h，细胞分化为巨噬细胞。分化好的巨噬细胞，换液(含0.3%BSA的无血清RPMI1640培养基)，同时加入 50 mg/L ox-LDL，在 37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，用油红O染色证实细胞中形成大量脂质小滴，提示已转变为泡沫细胞。

1.2.2 药品的配制 用DMSO分别将罗格列酮充分溶解，配制成实验浓度(通过MTT比色法确定)100倍的储备液，－70℃保存，临用前用培养液100倍稀释，0.22μm的一次性滤器过滤除菌，4℃ 保存。

1.2.3 实验分组及实验方法 浓度为1×107/L的巨噬细胞于12孔板里培养，每组设4复孔。分组对照组(巨噬细胞液中无药物干预)、泡沫细胞组(巨噬细胞液中加入终浓度50 mg/L的ox-LDL)、罗格列酮组(终浓度10μmol/L的罗格列酮和终浓度50 mg/L的ox-LDL)。各组在37℃、5%CO2培养箱中孵育48 h。

1.2.4 细胞内TC、ox-LDL、MDA的测定 用氯仿-甲醇法提取培养液中的TC。用ELISA法检测ox-LDL，按试剂盒操作步骤操作。

1.2.5 细胞内MDA的测定 按MDA试剂盒操作步骤操作。旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴 40 min，取出后流水冷却，4 000 r/min，离心10 min，取上清于532 nm处测定各管吸光度值。

1.3 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件进行分析，数据以±s表示，行两两间的t检验。

2 结果

2.1 THP-1细胞分化为巨噬细胞、泡沫细胞光镜下表现 光镜下THP-1细胞呈球形，悬浮生长，无限增殖。经PMA刺激后细胞失去原来悬浮生长的特性和增殖性，由悬浮状态变成贴壁状态，胞体变大，形态不规则，呈梭形、或椭圆形等，胞内可见较多颗粒，提示巨噬细胞形成。再与ox-LDL孵育后，油红O染色细胞中形成大量脂质小滴，表明已转变为泡沫细胞。见图1。

2.2 各组细胞中的TC、ox-LDL、MDA水平 细胞与10μmol/L的罗格列酮作用48 h后，泡沫细胞形成，细胞内总TC、游离TC、TC酯、ox-LDL、MDA 均增多(P＜0.05);罗格列酮干预后，细胞内总 TC、游离TC、TC酯、ox-LDL、MDA均显著减少(P＜0.05)。见表1。

图1 THP-1细胞、巨噬细胞及泡沫细胞

表1 各组细胞中的胆固醇、ox-LDL、MDA水平(±s)

表1 各组细胞中的胆固醇、ox-LDL、MDA水平(±s)

与巨噬细胞组比较:1)P＜0.05;与泡沫细胞比较:2)P＜0.05

组别 TC(mg/L) FC(mg/L) CE(mg/L) ox-LDL(pg/L) MDA(mg/L)巨噬细胞组 18.8±2.5 14.3±2.0 3.9±0.9 10.33±2.13 0.98±0.06泡沫细胞组 120±10.11) 39.6±7.31) 81.7±7.91) 51.46±8.671) 11.23±1.781)罗格列酮组 19.3±2.12) 15.6±2.12) 3.8±1.02) 13.52±5.152) 1.02±0.092)

3 讨论

AS始发于儿童时期而持续进展，通常在中年或中老年出现症状。AS发病机制学说多种，但泡沫细胞的形成在AS形成过程中始终起着主要作用〔3，4〕。由于AS斑块表现为脂质和坏死组织的聚集，因此往往认为AS是退行性变。现认为本病是多因素共同作用的结果，首先是病变处有平滑肌细胞、巨噬细胞及T淋巴细胞的聚集;其次是包括胶原、弹性纤维及蛋白多糖等结缔组织和平滑肌细胞的增生;三是脂质的沉积，脂质斑块主要含有TC结晶及游离的TC和结缔组织。粥样斑块中脂质及结缔组织的比例含量决定斑块的稳定性，从而关系到急性缺血事件是否发生。TC过高，则会引起它的沉积，因为TC作为一种脂质是形成AS的主要原因之一，因此减少TC的流入或和促进流出，即减轻细胞内脂质负荷，具有重要的理论和实际意义。

TC形成LDL后透过内皮细胞深入内皮细胞间隙，单核细胞迁入内膜，此即AS病理改变的最早期。LDL被氧化成ox-LDL后，与巨噬细胞的清道夫受体结合而被摄取，形成巨噬源性泡沫细胞，形成病理变化中的脂纹。动脉中膜的血管平滑肌细胞(SMC)迁入内膜，吞噬脂质形成肌源性泡沫细胞，增生迁移形成纤维帽，形成病理变化中的纤维斑块。ox-LDL使上述两种泡沫细胞坏死崩解，形成糜烂粥样坏死物，粥样斑块就这样形成。从上述AS形成的机制得知，其关键因子为ox-LDL，如何防止LDL被氧化成ox-LDL就成了防治AS的核心之一。

尽管脂源性理论在AS发生中起着重要作用，但它无法解释4种现象:①ox-LDL受体(LDL-R)缺乏的患者(家族性纯合子型高胆固醇血症)或动物模型，由于巨噬细胞表面的LDL-R缺乏，LDL无法通过LDL-R途径被巨噬细胞摄取，但该类患者或动物模型AS的发病率却几乎是100%〔5〕。②体外试验中，即使将单核-巨噬细胞和平滑肌细胞和浓度非常高的LDL血浆共同培养后，也并不能诱导TC在细胞内的聚积。③LDL-R受细胞内TC含量的负反馈调节。LDL和LDL-R结合后，内吞进入巨噬细胞胞浆，与溶酶体结合后，在溶酶体酶的作用下，LDL中的蛋白质降解为氨基酸，而TC酯水解为游离TC和脂肪酸。但是，当细胞内TC的含量饱和时，便会反馈性调节细胞表面的LDL-R的数量减少，功能下调〔6〕。所以LDL经这一途径代谢只是一个生理过程，并不会引起TC在巨噬细胞内堆积。④多个流行病学调查结果显示，AS与高TC血症之间呈一种非线性关系，AS患者中合并高TC血症的不到60%，有40%多的患者血脂可完全正常。综上4个现象表明，高LDL与AS形成之间存在着中间致病环节。脂质氧化(ROS)理论的提出就能解释上述4种现象。ROS对机体有防御作用;也可为细胞内第二信使，参与正常生理功能;但过量，则会导致病理损伤。LDL被氧化修饰后形成ox-LDL可促进SMC增殖;抑制内皮细胞的血管舒张;具有免疫原性;破坏内膜完整性;增强T细胞趋化效应，参与炎症反应;基质金属蛋白酶(MMP)增加，影响斑块稳定性;上调清道夫受体表达，促使巨噬细胞摄取ox-LDL，但巨噬细胞无负反馈调节〔6〕，泡沫细胞形成进而增多;刺激内皮细胞(EC)释放单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、集落刺激因子(CSF)，促进单核细胞趋化并分化成组织巨噬细胞;抑制局部巨噬细胞迁移;刺激单核细胞/巨噬细胞表达白细胞介素(IL-1β)。以上机制导致了AS的发生，加剧着疾病的发展。

本课题发现泡沫细胞形成后，细胞内总TC、游离TC、TC酯、ox-LDL增多、MDA为ROS代表物亦增多，而噻烷二唑酮类药物罗格列酮(PPAR-γ配体)干预后，上述总TC、游离TC、TC酯、ox-LDL、MDA均减少，泡沫细胞形成减少，这可能为噻烷二唑酮类药物代表药物罗格列酮抗AS的机制之一。

1 苟连平，吕 湛，刘 利，等.罗格列酮对THP-1源性泡沫细胞ABCA1、Caveolin-1蛋白水平的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(23):3519-20.

2 何菊英，刘松青.一次性密度梯度超速离心分离人血清脂蛋白及无脂血清〔J〕.第三军医大学学报，2002;24(1):46.

3 刘介眉，严庆汉，路英奇，等.病理组织染色的理论方法和应用〔M〕.北京:人民卫生出版社，1983:93-4.

4 彭道泉，赵水平，聂 赛，等.载脂蛋白E与过氧化体增殖物激活型受体-γ基因多态性的相互作用及其与冠心病的关系〔J〕.中华心血管病杂志，2002;30(6):351-5.

5 Junyent M，Gilabert R，Jarauta E，et al.Impact of low-density lipoprotein receptormutational class on carotid atherosclerosis in patients with familial hypercholesterolemia〔J〕.Atherosclerosis，2010;208(2):437-41.

6 吕 湛，陈运贞.过氧化物酶体增殖体活化受体γ、肝脏X受体α、视黄酸X受体α活化对THP-1细胞ATP结合盒转运蛋白和CD36mRNA表达的影响〔J〕.中国病理生理杂志，2004;20(8):1381-4.

Effect of rosiglitazone on cholesterol and ox-LDL and malondialdehyde in THP-1-derived foam cells

GOU Lian-Ping，Lü Zhan，HU Hou-Xiang，et al.
Department of Cardiology，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China

Objective To study the effect of rosiglitazone on cholesterol，ox-LDL andmalondialdehyde(MDA)contents in THP-1-derived foam cells and explore the probable mechanism of rosiglitazone on atherosclerosis(AS).M ethods THP-1 cells were cultured.Macrophageswere induced from THP-1 cell by PMA.Model of foam cells were built by incubatingmacrophages with ox-LDL.Foam cells were incubated with 10μmol/L rosiglitazone for 48 h.MDA wasmeasured by TBARS，ox-LDL was detected by ELSIA and cholesterolwas measured by fluorescence spectrophotometricmethod.Results Macrophages incubated with ox-LDL formed into foam cells successfully.The intracellular total cholesterol(TC)，free cholesterol(FC)，cholesteryl ester(CE)，ox-LDL and MDA were increased(all P＜0.05)and these changeswere significantly attenuated by rosiglitazone(P＜0.05).Conclusions The anti-ASeffects of rosiglitazone are related to reducing cholesterol and oxidation.

Rosiglitazone;Foam cells;ox-LDL;Malondialdehyde

R96;R541.4

A

1005-9202(2011)12-2235-03

四川省卫生厅资助项目(080114)

吕 湛(1967-)，男，博士，教授，主要从事动脉硬化及心血管介入的基础与临床研究。

苟连平(1972-)，男，硕士，副教授，主要从事动脉硬化的基础与临床研究。

〔2011-01-04收稿 2011-03-19修回〕

(编辑 袁左鸣/曹梦园)