复元胶囊对兔膝骨关节炎软骨中胰岛素样生长因子-I及胰岛素样生长因子结合蛋白3表达的影响

牟方政 李荣亨 张文亮 肖彩芝 (重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆 40006)

复元胶囊对兔膝骨关节炎软骨中胰岛素样生长因子-I及胰岛素样生长因子结合蛋白3表达的影响

牟方政1李荣亨 张文亮 肖彩芝 (重庆医科大学附属第一医院中西医结合科，重庆 400016)

目的 观察复元胶囊对兔膝骨关节炎软骨中胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)表达的影响。方法 采用右后肢伸直石膏固定法造模，将44只雌雄各半新西兰大白兔随机分为正常组、模型组、盐酸氨基葡萄糖组、复元胶囊低、中、高剂量组。正常组4只，其余各组8只。各药物组每天灌胃1次，持续6 w。免疫组织化学法检测IGF-I、IGFBP3表达。结果 模型组IGF-I、IGFBP3表达积分明显高于正常组(P＜0.01);复元胶囊各剂量组与模型组比较，IGF-I表达积分不同程度升高(P＜0.05)，而IGFBP3表达积分不同程度降低(P＜0.01)，高剂量组显著。结论 复元胶囊具有防治膝骨关节炎作用，其机制可能与调节IGF-I、IGFBP3表达水平有关。

骨关节炎;胰岛素样生长因子-I;胰岛素样生长因子结合蛋白3复元胶囊

骨关节炎(OA)是一种中老年人常见的以关节软骨进行性退变为主的骨关节病。软骨合成与降解失衡是其退变的主要病理机制，而细胞生长因子和炎症细胞因子又是介导软骨合成与降解失衡的重要生化因素〔1〕。IGF-I作为一种具有促生长作用的重要调控因子，能够促进软骨细胞增殖和基质合成〔2〕，这与中医“主骨生髓”观点类似，因此常用补肾法防治骨关节炎。复元胶囊具有补肾活血作用，可通过降低炎症因子IL-1β、IL-6表达，抑制软骨降解〔3，4〕，但该方在促进软骨合成方面还有待于研究。本实验建立兔膝骨关节炎模型，观察软骨IGF-I、IGFBP3表达，探讨复元胶囊防治膝骨关节炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 重庆医科大学实验动物中心提供的健康新西兰大白兔44只，雌雄各半，体重(2.5±0.4)kg。合格证:SCXK(渝)20090011。实验药物复元胶囊由鹿茸、淫羊藿、生晒参、黄芪、丹参等组成，重庆希尔安药业有限公司生产，每粒胶囊重0.41 g，相当于生药3 g，仅供实验使用。对照药物盐酸氨基葡萄糖胶囊(奥泰灵)由香港澳美制药公司生产(国药准字Z20088501)，规格为每粒含盐酸氨基葡萄750 mg。IGF-I抗兔多克隆抗体、IGFBP3抗兔多克隆抗体、SP免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒由北京博奥森生物技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 分组 将44只新西兰大白兔随机分为正常组、模型组、盐酸氨基葡萄糖组、复元胶囊低、中、高剂量组。正常组4只，其余各组8只，每只均单笼饲养。

1.2.2 造模 所有实验动物同等条件下适应性饲养1 w后，除正常组外，其余各组采用右后肢膝关节伸直石膏固定法造模〔5〕:实验兔放入固定器，先剪去右后肢踝关节以上的兔毛，用医用纱布裹上两层，再用管型石膏将其伸直位固定，石膏外以透明胶纸封好，若石膏松动或脱落者及时重新固定，持续6 w，造成膝骨关节炎模型。

1.2.3 给药 根据Meeh-Rubner公式，按成人(60 kg)体表面积与家兔体表面积换算等效剂量，复元胶囊中剂量组给予等效剂量2 700 mg·kg－1·d－1，复元胶囊低剂量组 1 350 mg·kg－1·d－1，复元胶囊高剂量组5 400 mg·kg－1·d－1，盐酸氨基葡萄糖组90 mg·kg－1·d－1。造模后1 w开始给药，除正常组和模型组外，各组药物饮用水溶解后灌胃，1次/d，持续6 w。

1.2.4 取材 用药6 w后，处死实验动物，切取股骨内侧髁完整软骨及软骨下骨组织标本，其中正常组取双后肢软骨做标本，用4%多聚甲醛溶液固定20 h，15%EDTA脱钙3～5 w，磷酸盐缓冲液充分冲洗，石蜡纵向包埋固定，常规切片。

1.2.5 主要观察指标 按照免疫组织化学染色法(SP法)操作说明检测IGF-I、IGFBP3表达。每张切片选取6个高倍视野(400倍)，其中三个视野包括表中层、三个视野包括中深层，由两个不同观察者完成。细胞染色为黄色或棕色为阳性细胞，参考Pelletier等〔6〕方法计算每个高倍视野下的阳性细胞计数和细胞总数。IGF-I、IGFBP3阳性软骨细胞用细胞分数表示。

1.3 统计学分析 应用SPSS16.0统计软件，数据以±s表示，采用单因素方差分析，两组间比较用LSD-t检验。

2 结果

2.1 IGF-I、IGFBP3表达阳性细胞形态学表现 正常组软骨仅在表层和中上层见到少许阳性细胞;模型组软骨细胞可见不同程度着色，软骨细胞的胞浆及胞核可见黄色及棕色着色，IGF-I以核染色为主，IGFBP3以胞浆染色为主，软骨各层均可见阳性细胞，但以中层更为显著;模型组与盐酸氨基葡萄糖组无明显差异;复元胶囊各剂量组IGF-I表达阳性细胞增多，着色棕黄为主，IGFBP3表达阳性细胞相对减少，着色淡黄为主。见图1。达积分升高，IGFBP3表达积分降低(P＜0.05，P＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠软骨中IGF-I、IGFBP3表达(±s)

表1 各组大鼠软骨中IGF-I、IGFBP3表达(±s)

与正常组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01;与盐酸氨基葡萄糖组比较:4)P＜0.05，5)P＜0.01

组别 n 4 1.68±0.16 1.88±0.23模型组 8 4.15±0.541) 5.52±0.581)盐酸氨基葡萄糖组 8 4.20±0.31 5.46±0.34复元胶囊低剂量组 8 4.54±0.422) 5.23±0.323)复元胶囊中剂量组 8 4.78±0.682)4) 4.68±0.463)5)复元胶囊高剂量组 8 5.02±0.742)4) 3.35±0.283)5)IGF-I IGFBP3正常组

图1 各组IGF-I，IGFBP3阳性细胞学形态(DAB，×400)

2.2 IGF-I、IGFBP3表达阳性细胞形态学计量 模型组IGF-I、IGFBP3表达积分与正常组比较均升高(P＜0.01)。复元胶囊各组与模型组比较，IGF-I表达积分不同程度升高，而IGFBP3表达积分则不同程度降低(P＜0.05，P＜0.01)，高剂量组显著。复元胶囊中高剂量组与盐酸氨基葡萄糖组比较，IGF-I表

3 讨论

IGF-I是人体内一种与胰岛素结构相似的重要生长因子，主要由肝脏、骨及软骨组织细胞合成，通过内分泌、旁分泌或自分泌方式作用于靶器官，与组织细胞表面IGF-I受体结合后，激活PI3K和MAPK信号通路发挥多种生物学效应，可以促进细胞增殖、细胞分化、细胞迁移，抑制细胞凋亡，调节生长发育，机体代谢，抗衰老等过程，对机体多个系统的损伤及修复具有十分重要的作用。在软骨中IGF-I通过促进软骨细胞产生基质多糖和胶原蛋白，抑制软骨细胞凋亡〔2〕，维持软骨合成与降解平衡，但IGF-I这一生理效应受胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)调控，IGFBPs与IGF-I结合可以降低IGF-I与其受体之间的亲和力，从而抑制了IGF-I的生物活性〔7〕。

OA以软骨退行性改变为主要表现，势必存在软骨细胞分泌IGF-I不足，但事实上则相反，国外研究证实在骨关节炎软骨细胞中IGF-ImRNA表达增加，比正常高3.5倍，IGFBP3表达也增加，且比正常高24倍〔8〕。软骨细胞合成IGF-I增加，理应能够促进软骨合成而发挥自我修复，但是软骨病理形态改变并没有因此减轻，这可能与IGFBP3表达增加更多有关。IGFBP3表达增加，与IGF-I结合增多，抑制IGF-I与其受体结合，从而IGF-I促软骨合成效能降低，导致软骨退变。

OA相当于中医“骨痿”“骨痹”范畴。中医认为本病多因年迈肝肾亏虚，气血不足，风寒湿邪侵入骨骼，以致血瘀阻经络所致。肾藏精，主骨生髓;肾精足则骨髓充，骨骼得以滋养，筋骨坚强。本病主要病机特点为本虚标实，本痿标痹，以肾精不足，筋骨失养为本，以痰湿血瘀，痹阻筋络关节为标。复元胶囊从临床上治疗骨关节炎行之有效的复元汤化裁而来，由鹿茸、淫羊藿、丹参、生晒参、黄芪等中药配伍而成，具有补肾活血益气之效。前期研究提示该药可以通过降低骨关节炎软骨中IL-1表达，增强TGF-β2表达，调节MMPs/TIMPs平衡起到防治骨关节炎的作用〔3〕。现代研究表明鹿茸提取物和淫羊藿提取物能够促进软骨细胞增殖、基质合成和抑制软骨细胞凋亡〔9，10〕;人参提取物可以促进缺血损伤脑组织IGF-I表达〔11〕;黄芪、丹参可促进MAPKs通路中ERK蛋白磷酸化水平的表达修复骨骼肌损伤，其作用与IGF-I类似〔12〕。本实验提示复元胶囊可能是通过调节IGF-I、IGFBP3表达水平，促进软骨修复，起到防治膝骨关节炎的作用。

1 Megumi Hashimoto，Tomoyuki Nakasa，Tomohiro Hikata，et al.Molecular network of cartilage homeostasis and osteoarthritis〔J〕.Med Res Rev，2008;28(3):464-81.

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9 李振华，赵文海，冷向阳.鹿茸多肽对兔骨性关节炎软骨细胞增殖及凋亡调节作用的实验研究〔J〕.世界中西医结合杂志，2009;4(10):701-3.

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Effect of FuYuan capsule on expression of IGF-I and IGFBP3 in cartilage of knee osteoarthritis rabbit

MOU Fang-Zheng，LIRong-Heng，ZHANG Wen-Liang，et al.
Department of Traditional Medicine Integrated W estern Medicine，the First Affiliated Hospital，Chongqing M edical University，Chongqing 400016，China

Objective To observe the influence of FuYuan capsule on IGF-Ⅰ and IGFBP3 in cartilage of rabbitwith knee osteoarthritis.Methods 44 healthy New Zealand big rabbits composed ofmale and female in equal were randomly divided into normal，model，glucosamine hydrochloride and different dose FuYuan capsule groups，4 in normal group and 8 in other groups.The right hind limbs of all model rabbitswere fixed by plaster bandage in the straight situation.Drug groups were respectively fed with glucosamine hydrochloride and different doses of FuYuan capsule one times daily for6 weeks.The levels of IGF-Ⅰand IGFBP3 in cartilage were detected through immunohistochemistry.The positive cells fraction and tinctorial strength were used by scoring method tomeasure the levels of IGF-I and IGFBP3.Results Total score of IGF-Iand IGFBP3 expressions in model group were higher than those of normal group(P＜0.01).Compared with FuYuan capsule groups，especially high-dose and model groups，the total score of IGFBP3 level was decreased significantly(P ＜0.01)，while the total score of IGF-Ⅰ levelwas increased(P ＜0.05).Conclusions FuYuan capsule can play an important role in prevention and treatment of osteoarthritis，which could be concerned to regulating the levels of IGF-Iand IGFBP3 in cartilage.

Osteoarthritis;Insulin-like growth factor I(IGF-I);Insulin-like growth factor bindingprotein3(IGFBP3);Fu Yuan capsule

R684

A

1005-9202(2011)12-2229-03

重庆市卫生局资助课题(No.〔2004〕12-B-55)

1 重庆市三峡中心医院中医科

李荣亨(1945-)，男，教授，博士生导师，主要从事中西医结合风湿病、肾病、老年病的防治研究。

牟方政(1981-)，男，在读硕士，主要从事中西医结合对老年病防治的研究。

book=1,ebook=794

〔2010-11-23收稿 2011-01-20修回〕

(编辑 曲 萌/曹梦园)