碳同位素在不同奶源鉴别中的应用探讨

崔琳琳,刘卫国

(1.西安交通大学环境科学与工程系,陕西西安 710049;2.中国科学院地球环境研究所,黄土与第四纪国家重点实验室,陕西西安 710075)

目前,食品安全问题受到全球的广泛关注,而同位素技术的应用给食品安全研究提供了新方法,并已成功的应用于蜂蜜、果汁、葡萄酒、油脂等食品的掺假检验[1-4],以及判断乳品、肉品等产地来源及追溯动物的饲料原料[5-7]等。

近年来,已有学者将稳定同位素技术应用到鉴别有机和非有机食品中,鉴别有机牛肉[8]或有机牛奶[9-10]。奶牛饮食中的同位素值通过食物链直接影响其产品的同位素值,因为对于动物源性食品,同位素比值虽然受动物代谢过程中同位素分馏的影响,但主要还是由饮食决定[11-12]的。有机奶是按有机标准生产,并经第三方严格认证的“最健康、最天然”的奶制品,与普通牛奶的不同主要在于饲料来源、奶牛的饲养方式。出产有机牛奶的奶牛是在天然牧场中放养、吃天然牧草长大的,牧草施的是天然肥料,两者饲料来源的不同也使其所产奶的同位素值有所不同。

奶牛摄入饲料的类型同样可以影响牛奶中的脂肪酸[13-14]。国外一些学者研究了有机牛奶与普通牛奶在脂肪酸含量方面的区别[9-10,15-17],认为有机奶的多不饱和脂肪酸及亚麻酸含量相对较高,但对于亚油酸的结果有些不同。Bergamo[15]和 Collomb[16]认为有机奶含有较多的亚油酸;而Molkentin[9-10]和 Ellis[17]则认为两者的亚油酸含量没有较大区别。在国内的报道中,普通奶与有机奶在脂肪酸含量上的区别还没有明确提出。

目前的研究表明,通过生物标记物和同位素手段鉴别有机和非有机牛奶可能会成为国际趋势。本实验主要是研究市售及奶源牛奶的脂肪酸及其稳定碳同位素,初步揭示国内一些品牌牛奶在脂肪酸、碳同位素方面的差异,特别是普通牛奶与有机奶的区别,并探讨奶牛饲料来源等方面的问题对这些指标的影响。

1 试验部分

1.1 样品采集

1.1.1 市售牛奶的采集 同一季节,在超市采购8种品牌的普通纯牛奶,代号分别为SSP-1～SSP-8,其中,SSP-1和 SSP-2同时有有机奶SSO-1和 SSO-2。

1.1.2 奶牛场的牛奶采集 取自陕西省西安市临潼区油槐镇的两处奶牛场,代号为NCP-1及NCP-2,这里的奶牛均采用家用饲料喂养,认为是普通奶源的代表。

1.1.3 天然牧场奶源 取自青海湖畔天然放牧的两处奶牛场,代号为 MCO-1及MCO-2,这些奶牛都处于天然放牧状态,饲料为天然牧草,认为是有机奶源的代表。样品信息列于表1。

表1 牛奶的采样信息Table 1 The information of milk collection

1.2 仪器与试剂

二氯甲烷、甲醇、正己烷、乙酰氯、脂肪酸标准物质(C12～C24)(均为色谱纯):德国 Meker公司产品;氯化钠(分析纯):由天津市北方天医化学试剂厂提供。

FD-1A-50型冷冻干燥机:北京博医康实验仪器有限公司产品;KQ-100DE型超声振荡器:昆山市超声仪器有限公司产品;气相色谱仪:美国Agilent公司产品,带有自动进样器;MAT-252型同位素质谱仪:美国 Thermo公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 提取并测定牛奶中的脂肪酸含量 将牛奶置于冰箱中冷冻成固体,然后在冷冻干燥机中冻干。称约50 mg牛奶粉末于烧杯中,加入V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=2∶1的混合溶液,超声震荡15 min,提取3次,将上清液吹干,向干燥的样品中加入3 mL盐酸化甲醇(V(甲醇)∶V(乙酰氯)=95∶5,在将乙酰氯加入甲醇之前,将甲醇冷冻至少30 min,避免反应过于剧烈)和少量的N2,立即盖上盖子,60℃加热12 h(overnight),将酯化后的样品冷却至室温,转移至长玻璃管中,加入3mL 5%NaCl溶液和4 mL正己烷,用Vortex抽提,取上层清液于小瓶中,吹干,用正己烷定容,做 GC分析(此实验方法参考文献[18])。

色谱柱:HP-1MS毛细管色谱柱(60.0 m×320μm×0.25μm);升温程序:初始温度40 ℃,保持1 min,以10℃/min升温至150℃,再以6℃/min升温至315 ℃,保持20 min;载气:氦气;进样口温度310℃;进样量1μL;分流比4.0∶1;柱流速 1.3 mL/min;检测器 FID温度320℃。

1.3.2 测定牛奶中的有机碳同位素 取约1 mg冻干的牛奶粉末于石英管内,加入氧化铜、铜丝和铂丝,抽好真空后密封,置于马弗炉内,850℃下恒温灼烧4 h,充分氧化。样品炉冷却至室温后,在真空系统中用酒精-液氮冷阱收集纯化CO2气体,最后用MAT-252型同位素质谱仪测定CO2的碳同位素。

碳同位素组成的表达式为:

式中:R样品为样品的碳同位素比值(13C/12C),R标准为标准的碳同位素比值(13C/12C)。

碳同位素组成相对于V-PDB标准。样品的测定精度用实验室工作标准控制,每批样品至少带一个工作标准,标准样品的重复分析误差小于0.2%。

2 结果与讨论

2.1 牛奶样品的脂肪酸种类及含量

根据牛奶脂肪酸的气相色谱图,采用面积归一化法定量,计算各脂肪酸的百分含量(g/100g脂肪酸总量),结果列于表2。

从表2可以看出,牛奶中饱和脂肪酸含量较高,以豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)及硬脂酸(C18:0)为主,3种脂肪酸占脂肪酸总量的50%以上,低级(碳14个以下)脂肪酸含量较低;而不饱和脂肪酸主要以油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、十六烯酸、十四烯酸、二十碳四烯酸、亚麻酸(C18:3n-9,12,15)等为主。而且,各种品牌的牛奶中主要脂肪酸含量没有明显差别,而这几种牛奶分别采自不同地区,这也表明地区差异对脂肪酸含量的影响较小。但对于普通奶与有机奶来说,有些脂肪酸含量稍有差别,主要体现在有机奶的PUFA含量明显高于普通奶,在MUFA方面差别不显著,而SFA含量稍低于普通奶。在多不饱和脂肪酸含量上的差别,以亚麻酸与亚油酸最为显著。这与奶牛所食饲料有关,奶牛瘤胃内的细菌可氢化75%～90%亚油酸和85%～95%亚麻酸,而奶牛摄入的高含量不饱和脂肪酸口粮能抑制奶牛瘤胃内多不饱和脂肪酸氢化,或者直接或间接地影响瘤胃环境(如p H),从而影响脂肪酸在瘤胃中的新陈代谢以及脂肪酸的含量[19-20]。新鲜牧草相比于农家饲料含有较高的多不饱和脂肪酸和高比例的亚麻酸,这就使以新鲜牧草为主要饲料的奶牛比以农家饲料为主要饲料的奶牛所产牛奶的脂肪酸含量相对较高。表2为所测不同类型牛奶样品的平均值,普通奶的亚麻酸含量在0.15%左右,而有机奶的亚麻酸含量在0.36%以上,与 Molkentin[10]研究的有机奶的亚麻酸含量有区别,这与脂肪酸的提取方法不同有关;而有机奶亚油酸含量比普通奶高出2%以上,这与 Molkentin[10]研究的结果不同,但与Bergamo[15]和 Collomb[16]的研究结果一致。

2.2 牛奶碳同位素比值分析

2.2.1 普通奶与有机奶的碳同位素比值 实验比较了市售的相同品牌的普通奶与有机奶,以及两处奶源地的牛奶,碳同位素比值结果列于表3。可以看出,有机奶场所产牛奶的碳同位素值在-27‰～-30‰之间,而普通奶场所产牛奶的δ13C为-16‰左右,从奶牛场来说,有机牛奶的δ13C值比普通奶的偏负很多;对于市售牛奶,普通牛奶的δ13C值为-16‰左右,而有机牛奶的δ13C值在-18‰～-20‰之间,较普通牛奶稍微偏负。

δ13C值反映了奶牛饲料中C3植物与C4植物的比例,即饲料中C3及C4植物的比值。植物的δ13C值与光合作用方式有关,C3植物δ13C值的变化范围为-23‰～-35‰,平均值约为-27‰,C4植物δ13C值的分布范围在-9‰～-19‰之间,平均值约为-13‰[21]。奶牛所食饲料中C3与C4植物配比不同,其所产牛奶的δ13C值也不同,列于表4。有机奶较普通奶的值偏负可以解释为出产有机牛奶的奶牛是在天然牧场中放养、吃天然牧草长大的,这些牧草可能会掺杂一些C4植物,但大部分都是C3植物[16,22];而出产普通奶的奶牛是在一般圈养的养殖场长大,它们基本上以农业玉米饲料为食,玉米是典型的C4植物,其δ13C偏正[2,16]。奶牛所食饲料的C3与C4植物比例就解释了其所产牛奶同位素值的差异。

表2 各市售普通纯牛奶的脂肪酸含量(g/100 g脂肪酸总量)Table 2 The content of fatty acids in various convention milk(g/100 g fatty acids)

表3 普通奶与有机奶平均脂肪酸含量(g/100 g脂肪酸总量)的差异Table 3 The difference of fatty acids content(g/100 g fatty acids)between convention and organic milk

表4 普通奶与有机奶的碳同位素δ13C对比Table 4 The carbon stable isotope ratio δ13C in convention and organic milk

另外,对于市售牛奶,为了使牛奶的保存期更长,厂商会进行高温处理或者加入一些添加剂,这可能使碳同位素之间有分馏,导致市售有机奶的碳同位素值较C3植物-23‰～-35‰的范围稍偏正,但这不影响有机奶与普通奶之间的同位素差异。

2.2.2 不同品牌牛奶的碳同位素比值 实验测定了8种不同品牌牛奶的碳同位素值,列于表5。结果表明,现市售的8种牛奶的同位素值没有明显区别,并与奶牛场的新鲜牛乳的同位素值接近。这些牛奶都是普通奶,所产这些牛奶的奶牛主要是以农业饲料为食,其碳同位素值在C4植物δ13C值的变化范围内,而这些农业饲料更多的是玉米饲料,不会因为地区不同而不同,所以对于这些市售普通牛奶,地区差异对其δ13C值的影响较小。

表5 8种品牌鲜牛奶的碳同位素值δ13CTable 5 The carbon stable isotope ratio δ13C in various convention fresh milk

3 结论

通过对不同奶源的初步研究得出以下结论:

1)对于市售不同品牌的普通纯牛奶,其脂肪酸含量和碳同位素比值没有明显差异,并且地区差异影响较小。

2)有机奶相比普通奶,其多不饱和脂肪酸含量相对较高,尤其在亚麻酸和亚油酸含量方面差异比较显著,普通奶的亚麻酸含量在0.15%左右,而有机奶的亚麻酸含量在0.36%以上,有机奶的亚油酸含量比普通奶高出2%以上。

3)有机奶的碳同位素比值相比普通奶明显偏负,因为出产有机奶的奶牛主要以天然牧草(C3植物)为食,而出产普通奶的奶牛饲料中更多的是家用饲料玉米(C4植物)。

[1]金青哲,施峰华,谢 峰,等.碳同位素比值法检测棕榈油掺入玉米油的研究[J].中国油脂,2009,34(1):73-75.

[2]马希汉,尉 芹.鉴别果汁真假的稳定同位素比率分析法[J].西北林学院学报,1994,9(2):99-102.

[3]PADOVAN G J,DE JONG D,RODRIGUES L P,et al.Detection of adulteration of commercial honey sample by the13C/12C isotope ratio[J].Food Chemistry,2003,82(4):633-636.

[4]GREMAUD G,QUAILE S,PIANTINI U P,et al.Characterization of Swiss vineyards using isotopic data in combination with trace elements and classical parameters[J].European Food Research and Technology,2004,219(1):97-104.

[5]孙丰梅,王慧文,杨曙明.稳定同位素碳、氮、硫、氢在鸡肉产地溯源中的应用研究[J].分析测试学报,2008,27(9):925-929.

[6]CRITTENDEN R G,ANDREW A S,L EFOURNOUR M,et al.Determining the geographic origin of milk in Australasia using multi-element stable isotope ratio analysis[J].International Dairy Journal,2007,17(5):421-428.

[7]CAMIN F,WIETZERBIN K,CORTES A B,et al.Application of multielement stable isotope ratio analysis to the characterization of French,Italian,and Spanish cheeses[J].J Agric Food Chem,2004,52(21):6 592-6 601.

[8]MANCA G,CAMIN F,COLORU G C,et al.Characterization of the geographicalorigin of Pecorino Cheese by casein stable isotope(13C/12C and15N/14N)ratios and free amino acid ratios[J].J Agric Food Chem,2001,49(3):1 404-1 409.

[9]MOL KENTIN J,GIESEMANN A.Differentiation of organically and conventionally produced milk by isotope and fatty acid analysis[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2007,388(1):297-305.

[10]MOL KENTIN J.Authentication of organic milk usingδ13C and theα-linolenic acid content of milk fat[J].Agricultural and Food Chemistry,2009,57(3):785-790.

[11]MASUD Z,VALL ET C,MARTIN GJ.Stable isotope characterization of milk components and whey ethanol[J].J Agric Food Chem,1999,47(11):4 693-4 699.

[12]BARBARA E.KORNEXL,WERNER T,et al.Measurement of stable isotope abundances in milk and milk ingredients—a possible tool for origin assignment and quality control[J].Z Lebensm Unters Forsch A,1997,205(1):19-24.

[13]黄艳玲,侯俊财.不同粗料对牛乳脂肪酸组成的影响[J].中国乳品工业,2009,37(7):27-29.

[14]张克春,徐国忠,沈 向.放牧奶牛的牛奶脂肪酸营养价值分析[J].乳业科学与技术,2010,1:37-38.

[15]JAHREIS C X,FRITSCHE J,STEINHART H.Monthly variations of milk composition with special regard to fatty acids depending on season and farm managementsystems-Conventional versus ecological[J]. Fett/Lipid,1996,98(11):356-359.

[16]COLLOMB M,BISIG W,BÜTIKOFER U,et al.Fatty acid composition of mountain milk from Switzerland:Comparison of organic and integrated farm systems[J].International Dairy Journal,2008,18(10/11):976-982.

[17]ELLIS K A,INNOCENT G,GROVE-WHITE D,et al.Comparing the fatty acid composition of organic and conventional milk[J].J Dairy Sci,2006,89(6):1 938-1 950.

[18]TOM L,PETER D N,TOM A M.Evaluation of extraction methods for recovery of fatty acids from lipid-producing microheterotrophs[J].Journal of Microbiological Methods,2000,43(2):107-116.

[19]BARGO F,DELAHOYJ E,SCHROEDER G F,et al.Milk fatty acid composition of dairy cows grazing at two pasture allowances and supplemented with different levels and sources of concentrate[J].Anim Feed Sci Technol,2006,125(1/2):17-31.

[20]REGO O A,ROSA H J D,PORTU GAL P V,et al.The effects of supplementation with sunflower and soybean oils on the fatty acid profile of milk fat from grazing dairy cows[J].Anim Res,2005,54(1):17-24.

[21]BENDER M M,ROUHANI I,VINES H M,et al.13C/12C ratio changes in crassulacean acid metabolism plants[J].Plant Physiol,1973,52(5):427-430.

[22]张恩楼,沈 吉,夏威岚,等.青海湖沉积物有机碳及其同位素的气候环境信息[J].海洋地质与第四纪地质,2002,22(5):105-108.