bFGF对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡及fractalkine表达的影响

韩江全， 于奎营， 胡泳涛， 林冬融， 黄名璐

(遵义医学院第五附属(珠海)医院神经内科，广东珠海519100)

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是1974年由Gospodarowicz等从牛脑垂体中提取的一种具有多种生物学活性的多肽因子，正常情况下可促进细胞分裂增殖，病理情况下参与损伤组织的修复，研究表明，bFGF可促进神经元存活及生长，对受损神经细胞起明显保护作用，是一种有效的神经营养因子。最近报道bFGF能减少缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡的发生［1］，但其具体作用机制目前尚未完全明了，本实验通过建立大鼠脑缺血再灌注模型，观察bFGF对脑缺血再灌注损伤后脑组织中Fractalkine含量及凋亡神经细胞数目的影响，探讨bFGF对缺血性脑损伤的保护机制，从而为bFGF的应用提供实验依据。

材料和方法

1 实验动物与分组

健康雄性SD大鼠36只(遵义医学院珠海校区中心实验室提供)，周龄8－9周，体重250－280 g，随机分为3组:假手术组(12只)，缺血再灌注组(12只)，bFGF组(12只)。每大组各取6只用于TTC染色，6只用于检测凋亡细胞及fractalkine检测。

2 方法

2.1 动物模型的制备 实验大鼠以戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，采用Longa线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型，缺血再灌注组及bFGF组均予缺血1 h后，分别于再灌注24 h各取6只大鼠灌注取脑，固定、脱水、透明、包埋，正常组不做任何处理，假手术组只分离不插线，于术后24 h各取6只灌注取脑，固定、脱水、透明、包埋。

2.2 给药方法 bFGF由北京博奥森公司提供，用注射用水稀释，bFGF组腹腔注射10 μg·kg－1，缺血后即刻给药，其余组同时腹腔注射等量生理盐水。

2.3 神经功能评分 参照Zea Longa 5分制评分标准，分别于各时点对实验大鼠进行神经功能评分:0分:无神经功能缺失症状;1分:轻度局灶性神经功能缺失(不能完全伸展对侧前肢);2分:中度局灶性神经功能缺失(向对侧转圈);3分:重度局灶性神经功能缺失(向对侧倾倒);4分:不能自发行走，意识水平降低。

2.4 测定梗死面积 3组动物各取6只于缺血再灌注24 h行神经功能评分后处死，NS灌注后取脑，置于－20℃冰箱中速冻20 min后，自视交叉前后(因为大脑中动脉在视交叉外侧向后外走行，它的深穿支一般在视交叉平面垂直穿入周围的基底节区，在此平面可见到坏死区、半暗带和正常区)分别行冠状切片，厚度2 mm/片，置于20 g/L氯化2，4，5－三苯四氮唑(TTC)溶液，37℃避光孵育30 min，4%多聚甲醛固定24 h，拍照并计算梗死面积。

2.5 细胞凋亡检测 采用TUNEL法原位标记DNA片段检测凋亡细胞，具体操作严格按照细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基公司产品)说明书进行。在缺血半暗带区取5个高倍视野，计数阳性细胞总数(镜下核染为棕黄色)，计算每高倍视野内的阳性细胞均数。

2.6 免疫组化检测fractalkine表达 采用SABC法，石蜡切片常规脱蜡至水，过氧化氢封闭，抗原热修复20 min，血清封闭，抗体稀释液1:100稀释Ⅰ抗(fractalkine rabbit mAb，购自北京博奥森生物制剂有限责任公司)。滴加Ⅰ抗，4℃孵育过夜，次日室温复温30min，移去Ⅰ抗，4℃过夜，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗，滴加生物素化的羊抗兔IgG 37℃孵育1 h，PBS洗，滴加ABC复合物37℃孵育1 h，PBS液洗，DAB显色，脱水透明封片，显微镜观察，阳性细胞呈棕黄色，在每张切片皮质区随机取不相重复的5个视野，数码相机拍照，MiVnT显微生物图像分析系统对所拍图像进行分析，统一光饱和度、亮度和色调，取平均灰度级算术均数用于各组间比较。

3 统计学处理

数据采用SPSS 16.0软件分析系统处理，以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析检验。取α=0.05作为检验水准。

结 果

1 HE染色脑组织病理学变化

假手术组中未见梗死改变，神经细胞形态正常，胞膜、核膜清晰，核仁明显;缺血再灌注组及bFGF组可见稳定梗死灶，皮质梗死中心区神经细胞脱失明显，残存细胞多无完整的细胞结构，细胞核固缩深染，核仁消失。梗死区周围神经细胞数目减少，且肿胀、坏死、脱失，分布不均匀，细胞周围及间隙增宽，水肿明显。bFGF组梗死灶中心神经细胞脱失亦较明显，较缺血再灌注组无明显差别，缺血半暗带内细胞形态较缺血组规则，脑组织损害程度明显减轻，见图1。

Figure 1.The hematoxylin and eosin staining of cerebral cortex of ischemic penumbra(×400).图1 各组脑缺血半暗带皮层组织HE染色

2 神经功能评分

假手术组全部动物均未检测到神经功能缺损(0分)，其余各组大鼠麻醉清醒后即出现不同程度的神经功能缺损。神经功能缺损评分方差分析:(1)缺血再灌注组与假手术组比较，神经功能缺损程度明显加重，P＜0.05;(2)bFGF组与缺血再灌注组比较，神经功能缺损评分明显降低，P＜0.05，见表1。

3 TTC染色测梗死面积

假手术组TTC染色后未见有白色梗死区域，缺血再灌注组与bFGF组可见到明显苍白色梗死区，与缺血再灌注组相比，bFGF组白色梗死区域明显减小(P＜0.05)，见表1、图2。

4 TUNEL染色及光镜下凋亡细胞计数

光镜下假手术组可见少量凋亡细胞，缺血对照组可见有大量凋亡细胞，与假手术组相比明显增多，P＜0.05;bFGF组凋亡细胞计数与缺血对照组比较明显减少，(P＜0.05)，见表1、图3。

表1 各实验组动物神经功能评分、梗死面积、凋亡细胞数目及免疫组化灰度级比较Table 1.The difference of functional score，infarct size，TUNEL+cell count and fractalkine expression among the three groups

5 Fractalkine免疫组织化学染色

假手术组可见fractalkine表达，缺血再灌注组与假手术组比较fractalkine表达减少，P＜0.05，bFGF组与缺血再灌注组比较fractalkine表达明显增多，(P＜0.05)，见表1、图4。

Figure 2.TTC staining of the brain slices 24 h after operation.The pale area represents the infarct region.图2 术后24 h脑片TTC染色图

Figure 3.The TUNEL staining of cerebral cortex of ischemic penumbra in different groups(×400).There were few apoptotic cells in sham group，and there were many apoptotic cells dyed brown in ischemia－refusion group.Compared with ischemia－refusion group，the number of brown cells in bFGF group was significantly reduced.图3 脑缺血半暗带皮层组织TUNEL染色

Figure 4.The IHC staining of fractalkine in cerebral cortex of ischemic penumbra(×400).图4 各组脑缺血半暗带皮层组织fractalkine免疫组织化学染色

讨 论

缺血性脑损伤的机制比较复杂，涉及能量代谢障碍、局部酸中毒、炎症介质释放、自由基损伤、细胞内Ca2+超载、兴奋性氨基酸的毒性作用等［2］，其中炎症反应在缺血性脑损伤中起到重要作用，fractalkine(Fkn)即CX3CL1，属于其中的CX3C家族，是一种新型的炎症趋化因子，具有不同于其它趋化因子的作用，在生物体中，Fkn主要起趋化和黏附作用［3］，Zhuang等［4］发现Fkn在神经元和胶质细胞的联系方面发挥重要作用。新近大量研究显示Fkn在中枢神经系统损害中起到重要保护作用，它抑制跨膜蛋白受体Fas介导的细胞凋亡［5］，并能对抗谷氨酸的毒性作用，Fkn还可阻止脂多糖(lipopolysaccharide)诱导细胞分泌TNF－α，有效减少损伤后神经细胞凋亡［6，7］。本实验中缺血再灌注组Fkn表达量较假手术组明显减少，细胞凋亡数目增加，进一步表明Fkn参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程。

寻找确切有效的脑保护药物和措施一直是缺血性脑血管疾病研究的热点，bFGF是一种具有多种生物学活性的营养因子，在中枢神经系统内，bFGF在保护神经元免受各种因素所致神经元变性和死亡中发挥着重要作用，其受体分布于多种神经细胞的细胞膜表面，bFGF与受体结合，引起受体二聚化，产生信号转导和细胞效应［8］。已有研究表明，脑组织受到各种损伤时，外源性bFGF可通过血脑屏障而发挥其神经保护作用［9］，目前认为的神经保护机制主要涉及以下几个方面:(1)抗兴奋性氨基酸的兴奋毒性作用;(2)阻止Ca2+内流，维持细胞内Ca2+的稳定;(3)降低NO神经毒性作用。本实验发现，与缺血再灌注组相比，bFGF组fractalkine表达明显增多，细胞凋亡数目减少，梗死面积明显减小，这表明fractalkine具有明显的抗细胞凋亡，增强脑组织对缺血再灌注损伤的耐受作用;bFGF能减少脑缺血再灌注损伤后缺血半暗带区的神经细胞凋亡，促进神经细胞存活，其神经保护作用可能通过上调fractalkine表达来实现。

［1］Ay I，Sugimori H，Finklestein SP.Intravenous basic fibroblast growthfactor(bFGF)decreases DNA fragmentation and prevents downregulation of Bcl－2 expression in the ischemic brain following middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Brain Res Mol Brain Res，2001，87(1):71－80.

［2］韩江全，李 均，李官成.葛根素对大鼠脑缺血侧皮质、纹状体区神经元凋亡及胶质细胞源性神经生长因子的影响［J］.第三军医大学学报，2009，31(19):1912－1913.

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［4］Zhuang ZY，Kawasaki Y，Tan PH，et al.Role of the CX3CR1/p38 MAPK pathway in spinal microglia for the development of neuropathic pain following nerve injuryinduced cleavage of fractalkine［J］.Brain Behav Immun，2007，21(5):642 － 651.

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