远志皂苷元对H2O2诱导的大鼠海马神经元损伤的影响及其机制*

张 晶， 戚仁斌， 汪志刚， 赵彦儒， 王华东， 陆大祥

(暨南大学医学院病理生理学系，暨南大学脑科学研究所，国家中药管理局三级科研实验室，广东 广州510632)

材 料 和 方 法

1 动物与主要试剂

1.1 动物 新生24 h 内SD 乳鼠，SPF 级，由南方医科大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK 粤2006－0015。

1.2 主要试剂 远志皂苷元，购于成都曼斯特生物科技有限公司，纯度＞98%。DMEM－F12 培养基、胎牛血清购于Hyclone。Neurobasal 培养基、B27 购于Gibco。四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、Hoechst 33258 购于Sigma。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。Trizol 购于Invitrogen。逆转录试剂盒购于Promega。SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量试剂盒购于TaKaRa。3－磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体、Bcl－2、Bax 兔抗大鼠多克隆抗体来自CST。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 来自北京鼎国昌盛生物有限公司。

1.3 主要仪器 微量核酸分光光度计(Thermo scientific)，多功能全波长酶标仪(Tecan)，荧光显微镜(Olympus)，梯度PCR 仪(PerkinElmer)，lightcycler 480 实时荧光定量PCR 仪(Roche)，Western blotting蛋白印迹电泳仪和蛋白印迹电转仪(Bio－Rad)。

2 方法

2.1 细胞培养及模型建立 新生24 h 内的SD 大鼠，无菌条件下断头取脑，分离海马组织，置于终浓度为0.125%胰酶的PBS 中，快速剪成1 mm×1 mm×1 mm 左右组织块，37 ℃消化10 min，用含10%胎牛血清的DMEM－F12 培养基终止消化，200 目筛网过滤，收集滤液，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，重悬细胞，计数后以3.5 ×108/L 的密度种于培养板(多聚赖氨酸包被过夜)中，4 h 后全量换为含2%B27 的Neurobasal 培养基。细胞培养至第6 d，经MAP2 鉴定神经元纯度后，用于后续实验。实验分正常组、H2O225 μmol/L、H2O250 μmol/L、H2O275 μmol/L、H2O2100 μmol/L 4 个浓度模型组，培养12 h 后，每孔加入0.5% MTT 溶液20 μL，继续培养4 h，弃培养液，每孔加入DMSO 150 μL，充分溶解，酶标仪570 nm 波长测定吸光度(absorbance，A)值，检测细胞存活率。

2.2 Sen 对H2O2损伤的海马神经元的影响

①Sen 对海马神经元存活率的影响 海马神经元接种于96 孔板中，实验分正常组及Sen 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L 5 个组，培养2 h 和12 h 后，MTT 法检测细胞存活率，筛选对神经元无损伤的药物浓度。

②Sen 对氧化损伤海马神经元存活率的影响 96 孔板中分别加入20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L Sen，预培养12 h，然后加入终浓度为50 μmol/L 的H2O2，继续培养12 h，MTT 法检测细胞存活率。

③MDA、SOD 检测 细胞分组同②，药物干预神经元后，裂解、收集细胞。取100 μL 收集液按照SOD和MDA 试剂盒说明书操作，测定吸光度值，并用BCA 法对细胞蛋白含量测定。

2.3 Sen 对H2O2损伤的海马神经元的作用机制研究

①Sen 对H2O2损伤的海马神经元凋亡的影响 Hoechst 33258 是一种能够穿透胞膜，结合DNA 的蓝色荧光染料，常用于细胞凋亡的检测。海马神经元经药物处理后，弃去培养基，4%多聚甲醛固定10 min，然后PBS 清洗2 次，加入Hoechst 33258 避光染色10 min，倒置显微镜下拍照。

②Real－time PCR 检测bcl－2 和bax 基因表达 实验分为4 组，正常组、50 μmol/L H2O2组、Sen 20 μmol/L +H2O2组和Sen 20 μmol/L 药物组。Trizol法提取各组细胞总RNA，然后微量核酸分光光度计分析RNA 浓度和纯度。按照Promega 逆转录试剂盒说明书操作，取2 μg RNA 为模板逆转录合成cDNA，逆转总体系为25 μL。取逆转产物cDNA 2 μL 进行PCR 循环。设置反应为95 ℃10 s，60 ℃10 s，72 ℃10 s，42 个循环。反应完毕后数据采用2－ΔΔCT方法处理。根据GenBank 序列，采用分子生物学分析软件Primer 5.0 设计引物，序列如下:bcl－2 上游引物5'－TGAACCGGCATCTGCACAC－3'，下游引物5'－CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG－3'，产物长度116 bp。bax 上游引物5'－AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG－3'，下游引物5'－GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA－3'，产物长度197 bp。GAPDH 上游引物5'－GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG－3'，下游引物5'－ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA－3'，产物长度143 bp。

③Western blotting 检测Bcl－2 和Bax 蛋白表达 实验分组同real－time PCR，弃板中培养液，每孔中加入60 μL 细胞裂解液裂解30 min，然后转移到离心管中，4 ℃12 000 r/min 离心10 min，分装上清，－80℃保存。蛋白经BCA 法定量后，配制SDS 聚丙烯酰胺凝胶，上样电泳，蛋白电转移，抗体孵育，显影。结果以目的条带与GAPDH 条带的灰度比值评定蛋白质表达相对含量。

④Caspase－3 活性检测 实验分组同real－time PCR，室温下解冻100 ×酶作用物和缓冲稀释液，涡旋振荡器混匀酶作用物，用缓冲稀释液将100 ×酶工作液稀释至1 ×酶工作液，临用前配好。按照培养液∶酶工作液=1∶1 比例向96 孔板中加入酶工作液，微量振荡器振荡30 s，25 ℃孵育60 min，酶标仪检测发光值。

3 统计学处理

SPSS 13.0 统计软件进行统计学处理，计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。

结 果

1 模型建立

细胞培养6 d 后，胞体呈梭形或三角形，突起增多、延伸，并且可见突起延伸形成的网络，经MAP－2鉴定后，神经元数目占细胞总数90%以上，可用于实验。25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L H2O2作用神经元12 h 后发现，细胞损伤程度与H2O2浓度呈剂量相关性，MTT 结果显示，细胞存活率分别为(95.6 ±11.6)%、(73.1 ±6.8)%、(61.5 ±5.6)%、(58.8±9.5)%，本实验选择50 μmol/LH2O2作为细胞造模浓度，见图1。

Figure 1. Effect of different concentrations of H2O2 on cell viability in hippocampal neurons. ± s. n = 3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L.图1 H2O2 对海马神经元存活率的影响

2 Sen 对海马神经元的影响

2.1 Sen 对海马神经元存活率的影响 不同浓度Sen 与海马神经元共培养发现，与正常组相比，培养2 h，Sen 对细胞存活率未见明显影响，而培养12 h后，Sen 浓度为20 μmol/L 和40 μmol/L 时，细胞存活率分别为(116.3 ±2.7)%和(109.0 ±2.9)%，差异显著(P ＜0.05)，见图2。

Figure 2. Effect of different concentrations of Sen on cell viability in hippocampal neurons at different time points. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs 0 μmol/L.图2 不同远志皂苷元浓度和时间对海马神经元存活率的影响

2.2 Sen 对氧化损伤的海马神经元存活率的影响

与正常组相比，H2O2组细胞存活率约为(76.8 ±9.8)%，差异显著(P ＜0.05);与H2O2组相比，20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L Sen 药物预处理后，细胞存活率升高，分别为(90.5 ± 8.9)%、(87.8 ±8.1)%、(86.6±7.5)%，差异显著(P ＜0.05)，见图3。

Figure 3. Effect of Sen on viability of hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n =3. * P ＜0.05 vs control(non－treatment);#P ＜0.05 vs H2O2 group.图3 远志皂苷元对H2O2 诱导海马神经元损伤的存活率影响

2.3 Sen 对神经元胞内MDA 含量和SOD 活性的影响 与正常组相比，H2O2组细胞SOD 活性降低，MDA 含量升高，差异显著(P ＜0.05);与H2O2组相比，20 μmol/L Sen 预处理组细胞，SOD 活性提高，MDA 含量降低，差异显著(P ＜0.05);其它浓度组未见明显区别，见表1。

表1 远志皂苷元对H2O2 诱导的海马神经元内SOD 活性和MDA 含量的影响Table 1. Effect of Sen on activity of SOD and content of MDA in hippocampal neurons treated with H2O2(±s.n=3)

表1 远志皂苷元对H2O2 诱导的海马神经元内SOD 活性和MDA 含量的影响Table 1. Effect of Sen on activity of SOD and content of MDA in hippocampal neurons treated with H2O2(±s.n=3)

* P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs H2O2 group.

Group SOD(103U/g protein) MDA(μmol/g protein)Control 26.72±2.08 1.48±0.09 H2O2 50 μmol/L 13.10±0.95* 2.70±0.26*H2O2+Sen 20 μmol/L 19.60±3.95# 1.99±0.15#H2O2+Sen 30 μmol/L 18.80±1.68 2.31±0.10 H2O2+Sen 40 μmol/L 18.61±2.04 2.38±0.16

3 凋亡相关检测结果

3.1 Hoechst 33258 染色形态观察 Hoechst 33258细胞核染色后拍照，图4A 示正常组，细胞核呈现均匀低强度荧光，见少量高亮浓染的凋亡形态细胞;图4B 示H2O2组，见大量细胞核浓染、高亮固缩，凋亡特征的细胞多于正常组;图4C 示20 μmol/L Sen +H2O2组，高亮蓝染的凋亡形态细胞比H2O2组少;图4D 示Sen 单独处理细胞组，凋亡特征形态的细胞数与正常组相比，未见明显差别。

Figure 4. Morphological changes of nucleus of apoptotic hippocampal neurons shown by Hoechst 33258 staining. The apoptotic cells are indicated by arrows (×200).A:control group;B:H2O2 50 μmol/L group;C:H2O2 +Sen 20 μmol/L group;D:Sen 20 μmol/L group.图4 远志皂苷元对H2O2 诱导的海马神经元损伤形态的影响

3.2 bcl－2 mRNA 表达 Real－time PCR 结果显示，与正常组相比，H2O2组抗凋亡基因bcl－2 表达下调，差异显著(P ＜0.05);与H2O2组相比，20 μmol/L Sen+H2O2组bcl－2 mRNA 表达升高，差异显著(P ＜0.05);Sen 单独处理组与正常组未见明显差异，见图5。

Figure 5. Effect of Sen on the expression of bcl－2 mRNA in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s. n=4. #P ＜0.05 vs control (non－treatment)* P ＜0.05 vs H2O2 group.图5 远志皂苷元对H2O2 诱导海马神经元bcl－2 mRNA 表达的影响

3.3 bax mRNA 表达 Real－time PCR 结果显示，与正常组相比，H2O2组bax表达下调，差异显著(P＜0.05);与H2O2组相比，20 μmol/L Sen +H2O2组bax mRNA 表达升高，差异显著(P ＜0.05);Sen 单独处理组与正常组未见明显差异，见图6。

Figure 6. Effect of Sen on the expression of bax mRNA in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n=3. #P ＜0.05 vs control(non－treatment);* P ＜0.05 vs H2O2 group.图6 远志皂苷元对H2O2 诱导的海马神经元内bax mRNA表达的影响

3.4 Bcl－2 蛋白表达 Western blotting 结果显示，与正常组相比，H2O2组Bcl－2 蛋白表达下降，差异显著(P ＜0.05);与H2O2组相比，20 μmol/L Sen +H2O2组Bcl－2 表达升高，差异显著(P ＜0.05);与正常组相比，Sen 单独处理组Bcl－2 表达升高，差异显著(P ＜0.05)，见图7。

3.5 Bax 蛋白表达 Western blotting 结果显示，与正常组相比，H2O2组Bax 蛋白表达上调，差异显著(P ＜0.05);与H2O2组相比，20 μmol/L Sen+H2O2组Bax 表达下降，差异显著(P ＜0.05)，见图8。

3.6 Sen 对caspase－3 活性的影响 与正常组相比，H2O2组caspase－3 活性升高，差异显著(P ＜0.05);与H2O2组相比，20 μmol/L Sen+ H2O2组细胞caspase－3 活性降低，差异显著(P ＜0.05)，见图9。

Figure 7. Effect of Sen on the expression of Bcl－2 protein in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n=3. *P ＜0.05 vs control (non－treatment);#P ＜0.05 vs H2O2 group.图7 远志皂苷元对H2O2 诱导的海马神经元内Bcl－2 蛋白表达的影响

Figure 8. Effect of Sen on the expression of Bax protein in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s. n =3. * P＜0. 05 vs control(non－treatment);#P ＜0. 05 vs H2O2 group.图8 远志皂苷元对H2O2 诱导的海马神经元内Bax 蛋白表达的影响

Figure 9. Effect of Sen on the activity of caspase－3 in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n =3. #P ＜0.05 vs control(non－treatment);* P ＜0.05 vs H2O2 group.图9 远志皂苷元对H2O2 诱导的海马神经元caspase－3 活性的影响

讨 论

近年来研究表明，ROS 引起的氧化应激与神经退行性疾病有密切联系，这与神经元需氧和耗氧高于机体内其它类型细胞有关，因此，神经元受到ROS攻击时，更容易产生氧化应激损伤。Ma 等［7］发现提高线粒体内SOD 活性，可以改善由于氧化应激引起的AD 模型小鼠Tg2576 小鼠记忆障碍;在快速老化小鼠SAMP10 的海马研究中发现，其神经元线粒体SOD 活性明显低于正常小鼠，而MDA 含量则高于正常小鼠(P ＜0.01)，说明其在其海马组织中的自由基含量有所增高，亦提示氧化应激损伤可能是AD 发生的重要因素之一［8］。Whittemore 等［9］通过H2O2诱导大鼠皮层神经元损伤，对细胞进行特异DNA 染色以及DNA ladder 检测，发现H2O2可能介导了Aβ 诱导的神经元凋亡;Hensley 等［10］运用水杨酸羟化法也证实在无细胞的Aβ(25－35)培养液中能够产生活性氧，而且氧化作用敏感的酶失活，如谷氨酰胺合成酶。此外，还有研究表明Aβ 可以通过ROS 氧化作用加重对神经细胞的损伤，增强细胞因子引起的炎症反应［1］。因此，氧化应激是AD 发病中的重要因素之一，也基于这个原因，从氧化应激多个环节来研究AD 发病机制和防治措施逐渐成为共识。

本室先前自拟中药Q0409 组方［4］和抗衰益智方Ⅰ［5］(主要成分为远志)可以改善SAMP－8 小鼠、东莨菪碱所致记忆障碍小鼠和自然衰老记忆障碍小鼠的学习记忆能力，并且能提高正常小鼠脑内乙酰胆碱含量，从而提高正常小鼠的学习记忆能力。为了进一步探讨Q0409 组方和抗衰益智方Ⅰ抗AD 机制，我们在此研究基础上，选择上述组方的主要单体成分之一远志皂苷元进行深入研究。已有的研究发现远志皂苷元具有一定的抗氧化损伤的作用，如田枫等［11］研究远志皂苷元能显著提高快速老化痴呆模型小鼠SAMP/8 脑组织总蛋白含量、总抗氧化能力和促进蛋白质和核酸的合成，孙桂波等［12］观察远志皂苷对H2O2诱导PC12 细胞损伤的作用，结果显示其能够明显改善细胞存活率，LDH 漏出量、MDA 含量降低，SOD 活性升高(P ＜0.01)。

本研究采用H2O2诱导的神经元氧化损伤模型，观察远志皂苷元对其作用并探讨机制，实验证实，50 μmol/L H2O2作用于海马神经元12 h 即可造成细胞氧化损伤，神经元存活率下降，SOD 活性降低，MDA 含量升高，而细胞经过Sen 预处理后，Sen 剂量与神经元存活率具有量效关系，20 μmol/L Sen 处理后抗氧化能力增强显著，这与文献报道皂苷物质对氧自由基本身影响较少，而大部分可能提高体内SOD 等抗氧化酶活性，从而减轻氧自由基对机体损伤［13］相一致。低浓度H2O2作用于细胞时，可通过影响凋亡信号转导与相关基因功能，造成细胞凋亡，其中Bcl－2 家族和caspase－3 家族在H2O2诱导的凋亡过程中起重要作用［14－16］。我们通过Hoechst 33258 染色发现，经H2O2作用后细胞核呈凋亡特征性改变，而20 μmol/L Sen 预处理组较H2O2组凋亡细胞减少，进一步观察Bcl－2 家族蛋白及caspase－3 表达，结果证实，与正常组相比，H2O2组Bcl－2 蛋白表达下调，Bax 蛋白表达上调，caspase－3 活性升高，而20 μmol/L Sen+ H2O2组，Bcl－2 蛋白表达增加，Bax 蛋白表达下降，caspase－3 活性降低，提示Sen 可能通过调节凋亡蛋白从而抑制细胞凋亡。

综上所述，远志皂苷元可以通过提高海马神经元抗氧化酶的活性，抑制H2O2诱导的细胞凋亡，从而起到保护神经元的作用，实验结果提示远志皂苷元具有防治AD 的应用前景，该作用机制还有待进一步研究证实。

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