苯甲酸钠对草履虫的毒性作用研究

刘俊，李霖，张晓燕

(扬州职业大学，江苏扬州225009)

苯甲酸钠(sodium benzoate，SB)又称安息香酸钠。随着食品工业的发展，SB被广泛应用于碳酸饮料、泡菜、酱油、食醋等食品中作为防腐剂。很多国家允许使用SB为食品防腐剂。过去曾认为SB对人体无毒，但最近的研究表明其可造成人体组织器官或机能的损坏，人体过量摄取会发生损坏肝脏甚至致癌等症状[1]，所以研究不同浓度的SB对生物细胞的损伤具有一定的意义。此外，很多种农药，包括杀虫剂、除草剂和灭菌剂属于或怀疑是环境内分泌干扰物质(EDC，endocrine disruptors chemicals)类物质，用于牙科修复的物质——双酚A，食品工业用的一些抗氧化剂如t－丁羟基茴香醚，以及塑料如苄丁基邻苯二甲酸酯和4-羟基-烷基苯酚也被列入外源雌激素[2]。食品防腐剂苯甲酸钠是否具有环境内分泌干扰物作用，目前尚无明确报道。

草履虫为单细胞生物，在水体中运动较快，能与周围介质充分接触，与多细胞生物相比，对毒性的反应更为灵敏，且宜采集、培养。用它来研究SB对细胞的毒害及环境雌激素作用是比较理想的实验料[3]。本研究旨在通过苯甲酸钠对草履虫的急性和慢性毒性作用研究，探索苯甲酸钠的毒性作用和环境雌激素作用。

1 材料与仪器

1.1 材料

1.1.1 实验动物

实验用草履虫采集于扬州市西区生活污水河的尾草履虫。

1.1.2 药品

苯甲酸钠(分析纯，上海光华化学试剂厂)。

1.2 主要仪器

XSP－13A显微镜，解剖镜，LRH-250-CT光照培养箱，微样移液器。

2 实验方法

2.1 草履虫纯化培养与计数

采用郭峰等[4]微量分离法。用50μL微量加样器取富集到的草履虫样液，在干净玻片上一排滴5滴，每滴10μL，在5×10倍镜下镜检，将含草履虫的那一滴水转吸到另一块干净载玻片上，加10μL稻草培养液，1∶1稀释变成20μL，用微量加样器在同一块载玻片上再将其分成2滴，每滴10μL，镜检，将含有草履虫的那一滴再加10μL稻草培养液再次1∶1稀释变成20μL，如此重复稀释3～5次，直到在10×100的高倍镜下镜检确认已无其他生物为止。最后，将含有草履虫的那一滴吸入含250mL稻草培养液的三角烧瓶中室温培养1周左右，取5滴各含10μL镜检，若除草履虫外仍有少数其他生物，可重复用上述微量分离方法再次进行分离纯化。

2.2 攻毒实验

用稻草培养液配制苯甲酸钠系列稀释液。通过逼近实验确定最小致死剂量和绝对致死剂量。在此范围内设置8个苯甲酸钠浓度组:8g·L－1、9g·L－1、10g·L－1、11g·L－1、12g·L－1、13g·L－1、14g·L－1、15g·L－1、16g·L－1、17g·L－1、18g·L－1、19g·L－1，以稻草培养液做空白对照，培养体积100μL，每管10个草履虫，光照培养箱中25℃培养。急性毒性实验培养1h，慢性毒性实验培养72h和168h。(SB浓度为10g·L－1、9g·L－1、8g·L－1、7g·L－1、6g·L－1、5g·L－1、4g·L－1、3g·L－1、2g·L－1、1g·L－1、0.8g·L－1、0.6g·L－1、0.4g·L－1、0.2g·L－1)计数存活草履虫个体数。

2.3 数据分析及设计方法

急性毒性实验数据处理:根据百分率与概率单位对照表，将死亡率转换成概率单位;概率单位为Y1，浓度对数为X1，应用SPSS软件对概率单位(Y1)与浓度对数(X1)进行回归分析，得到回归方程Y1=a1X1+b1，计算LC50。

慢性毒性实验数据处理:草履虫的种群增长速率计算公式:Y2(或Y3)=(lnNt－lnN0)·t－1，其中N0为草履虫的起始种群密度，Nt为t(h)时草履虫的种群密度，t为培养持续时间(h)。起始种群密度N0=起始个体数/培养液总体积;t(h)时种群密度Nt=t(h)时个体数/培养液总体积;应用SPSS软件对种群增长速率(Y2或Y3)与浓度对数(X2或X3)进行回归分析，得到回归方程Y2=a2X2+b2及Y3=a3X3+b3，分析草履虫种群增长率与苯甲酸钠浓度间关系。

3 实验结果

3.1 急性毒性实验

3.1.1 最小致死剂量和绝对致死剂量

最小致死剂量是指在一群生物中仅引起个别生物死亡的最低剂量，低于此剂量时就不能使机体出现死亡。绝对致死剂量是指引起实验生物全部死亡的最低剂量。经过多次逼近试验得出:苯甲酸钠对草履虫1h急性毒性最小致死剂量为8g·L－1，绝对致死剂量为19g·L－1。

3.1.2 半数致死浓度

半数致死浓度是使一群受试生物50%死亡的最低浓度。苯甲酸钠梯度浓度对草履虫1 h急性毒性实验结果见表1。以校正死亡率对应几率值(Y1)与浓度对数(X1)进行回归分析，得到回归方程Y1=10.051X1－6.563，(R2=0.965)，即浓度对数(X1)与几率值(Y1)之间呈线性关系，浓度越大，死亡率越高。并根据回归方程求得Y1=5时(死亡率50%)，苯甲酸钠对草履虫的1h LC50为14.14g·L。

表1 苯甲酸钠对草履虫的1h急性毒性作用结果

3.2 72h(三天)慢性毒性实验

表2 苯甲酸钠对草履虫的72h慢性毒性作用结果

草履虫72h慢性毒性实验结果如表2所示。种群增长率(Y2)和浓度对数(X2)之间呈线性关系，其回归方程为Y2=－0.0153X2+0.0347(R2=0.480)，即浓度在0.8－5g·L－1范围内，浓度对数越大，种群增长率越小;但是，如图1所示，在低浓度范围(0.2－0.8g·L－1)内种群增长率有逐渐上升趋势;在浓度5g·L－1时种群增长率急剧下降为最低值;浓度大于5g·L－1时，种群增长率又有一定上升趋势。

3.3 168h(一周)慢性毒性实验

草履虫一周慢性毒性实验结果如表3所示，种群增长率(Y3)和浓度对数(X3)之间的回归方程为Y3=－0.00884X3+0.0155(R2=0.391;P＜0.05)。即浓度在0.6－6g·L－1范围内，浓度对数越大，种群增长率越小。在中低等浓度范围内(0.2－0.6g·L－1)浓度对数越大，种群增长率呈缓慢增加趋势，在浓度6g·L－1时种群增长率急剧下降为最低值;浓度大于6g·L－1时，种群增长率又有一定上升趋势。

表3 苯甲酸钠对草履虫的168h慢性毒性作用结果

图1 苯甲酸钠对草履虫的慢性毒性作用结果

4 讨论

本实验中关于急性毒性研究的结果显示:苯甲酸钠溶液的浓度越高，草履虫的死亡率越高。这与有关原生动物的急性毒性研究报道结果相似。王莉霞等[5]研究表明，氰戊菊酯对原生动物群落的48h半致死浓度LC50为15.83mg·L－1，刘庆余等[6]研究显示，乙氰菊酯对草履虫的1h急性毒性实验，以甲苯为助溶剂时LC50为16.3mg·L－1，以丙酮为助溶剂时LC50为24.0mg·L－1。李霖[7－9]结果表明，三氟氯氰菊酯对草履虫1h急性毒性LC50为1.648mg·L－1;多菌灵对草履虫的1h LC50为0.5340mg·L－1，毒死蜱对尾草履虫的1h LC50为0.04359mg·L－1。本实验结果表明，苯甲酸钠对草履虫1h急性毒性LC50为1.103 g·L－1，显示草履虫对苯甲酸钠的敏感性远远小于菊酯、毒死蜱等农药，说明苯甲酸钠的毒性作用是很低的，但是浓度越大，死亡率越高，表明随着苯甲酸钠浓度的逐步升高，其生物毒性也逐步加大。

两组慢性攻毒实验结果都显示种群增长率和浓度对数之间呈线性关系，浓度对数越大，种群增长率越小，即浓度越大，对种群增长抑制作用越强。与1h急性毒性作用比较，苯甲酸钠对草履虫的最小全致死效应浓度随着毒性作用时间延长而降低，表明苯甲酸钠对草履虫的毒性作用既具有剂量效应，又具有时间效应。

值得注意的是72h、168h慢性毒性试验显示，在偏低浓度范围时，种群增长率大于对照组;种群增长率随着浓度的增加呈现逐渐上升趋势;在中等浓度范围内，种群增长率随着浓度的增加呈现逐渐下降趋势;在浓度5g·L－1、6 g·L－1时种群增长率急剧下降为最低值;在越过最低值后又出现一定范围内随浓度升高而明显上升的趋势。这一现象说明，苯甲酸钠在一定浓度范围内对草履虫生殖具有促进作用。

EDC是对生物的繁殖、发育、行为及保持动态平衡的体内天然激素的合成、分泌、传输、结合和清除起干扰作用的外源物质。EDC具有不寻常的量效效应，，传统的毒性阈值概念并不适合它。Vom[10]等报道在一定剂量范围内，低剂量EDC促进某种效应，而高剂量的EDC却产生抑制作用，形成“U”形量效曲线。李霖等[7－9]研究显示三氟氯氰菊酯、多菌灵、毒死蜱对草履虫慢性毒性作用在一定低浓度范围内呈现出浓度越大，种群增长率越高的现象，认为这种促进可能是具有环境内分泌干扰物作用的一种体现。本结果与其类似，尤其与三氟氯氰菊酯的作用相似，在中等浓度时浓度越高，对种群增长率的抑制作用越强，在越过最低值后种群增长率有逐渐上升趋势，浓度越高，对种群增长的促进作用越强。由此提示，草履虫种群增长率与苯甲酸钠浓度间具有显著的反应—剂量关系。这种反应—剂量关系与环境雌激素效应非常相似。苯甲酸钠是否具有环境雌激素的效应，还需通过进一步研究方可定论。

此外，慢性毒性还显示在高浓度平行组中，出现个别组种群增长率显著增加而其他组全部死亡的现象。有可能是由于草履虫对环境雌激素效应的应答具有一定个体差异，关于环境雌激素效应的机理还需进一步研究。

[1]胡明铅，王烔坤，蔡继业，等.应用原子力显微镜分析苯甲酸钠生物毒性[J].生物工程学报，2008，24(8):1428－1432.

[2]刘先利，刘彬，邓南圣.环境内分泌干扰物研究进展[J].上海环境科学，2003，22(1):57－61.

[3]陈天乙.尾草履虫毒性试验的研究[J].动物学杂志，1984(3):15－17.

[4]郭峰，张军，李文芳，等.一种简便实用的原生动物分离和计数方法[J].同济大学学报:医学版，2001，22(4):73－74.

[5]王莉霞，梁宇，刘国光，等.氰戊菊酯对原生动物群落的毒性[J].应用与环境生物学报，2005，11(1):49－51.

[6]刘庆余，周浩江，刘春龙，等.乙氰菊酯对草履虫的毒性[J].农村生态环境，1994，10(3):83－84.

[7]李霖，姚云珍，刘俊，等.三氟氯氰菊酯对草履虫的毒性作用研究[J].扬州大学学报:农业与生命科学版，2009，30(4):48－51.

[8]李霖，王君，刘俊，等.杀菌剂多菌灵对草履虫的毒性研究[J].江苏农业科学，2010(5):493－495.

[9]李霖，刘俊，顾庆龙，等.毒死蜱农药对尾草履虫的毒性研究[J].河南农业科学，2009(12):82－85.

[10]F S VOM SAAL，B G TIMMS，M M MONTANO，et al.Prostate enlargement in mice due to fetal exposure to low doses of estradiol or diethylstilbestrol and opposite effects at high doses[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94:2056－2061.