樱桃李茎段离体培养与快速繁殖技术1)

李海臣,兰士波,罗旭

(1.黑龙江省大兴安岭地区呼中林业局营林处,呼中 165000;2.黑龙江省林业科学研究所经济林研究室,哈尔滨 150081;3.黑龙江省林业科学院)

樱桃李(Prunus cerasiferaEhrh.)是中国珍稀濒危生物资源和世界宝贵野生果树资源,果肉柔软多汁,可溶性固形物含量高,酸味浓,口感风味独特,具良好食用和保健价值。树形介于灌木与乔木之间,耐寒力极强[1-2],天然分布在中亚天山、高加索、土库曼山地、帕米尔阿赖、伊朗、小亚细亚等山区,分布最东端在中国新疆伊犁。

樱桃李茎段离体培养不受自然周期性和非周期性气候条件变化的制约,且能保持原始亲本的优良性状和特性,具有获取遗传增益的潜力,总而言之,茎段离体培养是规模化、工厂化、快速繁殖苗木的主要方式[3]。笔者以当年萌生的幼嫩茎段为外植体,通过调整细胞分裂素和植物生长调节剂种类和浓度配比,优化离体培养的最适培养基,提出离体培养快速繁殖技术和示范,为彻底拯救、合理保护和创新利用这一珍稀种质提供科技含量高的优质苗木和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 外植体选择及消毒处理

在黑龙江省林业科学研究所森林培育学重点实验室、林口县林业局国家良种繁育基地分别开展离体培养及栽培驯化试验。茎段离体培养繁殖材料来源于引种栽培的5年植株上当年生幼嫩枝条,清除基部叶片,保留顶部1～2片叶,在洗洁精溶液(水∶洗洁精=1∶500)中清洗,除去表面灰尘。经蒸馏水冲洗后,剪成1.0～2.0 cm茎段,在超净工作台上,用0.1%HgCl溶液表面灭菌5～7min,再用无菌水冲洗5～6次,置无菌水中浸泡40～60min。然后,切除与消毒液接触的伤口部位,吸干材料表面水分。

1.2 培养基制作与培养环境控制

1.2.1 培养基制作。以MS、1/2MS、3/4MS为基本培养基,若无特别说明,其中均附加蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L。同时,根据试验设计要求,在基本培养基中,分别添加不同浓度配比的细胞分裂素(6-BA、KT)和植物生长调节剂(IAA、NAA、2,4-D),并置120 ℃条件下灭菌15 min。

1.2.2 培养环境控制。茎段立体培养对环境条件要求苛刻,在整个培养过程中,将环境条件控制在技术要求范围内。⑴工茎段腋芽培养:培养温度25±1.0℃,光照时间16 h/d,光照强度2月日500 lx,pH值5.8;⑵腋芽增殖培养:培养温度25±1.0℃,光照时间12 h/d,光照强度2000 lx,相对湿度90%,pH值5.8。

1.3 培养基筛选和优化

在无菌条件下,将灭菌茎段接种到添加细胞分裂素和植物生长调节剂种类和浓度配比不同的基本培养基(MS)上离体培养,以优化茎段腋芽萌发和丛芽再生的最适培养基。在离体培养的基础上,将诱导出的丛生芽单芽的芽尖或分化苗分别转接到含不同浓度植物生长调节剂的增殖培养基或生根培养基上增殖培养或生根培养,采用L9(34)正交试验设计和极差分析技术,筛选最适增殖培养基和生根培养基。

1.4 数据统计分析方法

⑴极差分析方法:运用美国北卡纳州州立大学研制的SAS(Statistical Analysis System)数据统计分析系统处理相关数据,其中:极差分析采用STAT模块的ANOVA和GLM完成;

3 结果与分析

3.1 灭菌时间对外植体的影响

在超净工作台上,用0.1%HgCl溶液进行外植体表面灭菌5～7min,经无菌水冲洗后,置无菌水中浸泡40～60 min。接种 3 d后,观察结果(表1)显示:灭菌不彻底的茎段出现污染及褐化现象,其中:经 0.1%HgCl溶液表面灭菌5 min,外植体污染率及褐化率分别为55%、20%,污染严重;经0.1%HgCl溶液表面灭菌6 min、7 min,外植体污染率较低(25%、15%),然而,表面灭菌7 min,外植体切口处褐化程度严重,褐化率60%。由此可见,经 0.1%HgCl溶液表面灭菌 6 min效果理想,茎段污染率最低,褐化程度最轻。

表1 灭菌时间对外植体的影响

3.2 外植体腋芽萌发和生长诱导

在无菌条件下,将茎段接种到附加细胞分裂素、植物生长调节剂种类及浓度配比不同的基本培养基上,以诱导腋芽萌发和生长。试验设计6种腋芽萌发及丛芽再生培养基,分别为:IABA-MS+IAA 0.4mg/L+6-BA 0.8mg/L;IAKT-MS+IAA 0.4mg/L+KT 0.8mg/L;4DBA-MS+2,4-D 0.4mg/L+6-BA 0.8mg/L;4DKT-MS+2,4-D 0.4mg/L+KT 0.8mg/L;NABA-MS+NAA 0.4mg/L+6-BA 0.8 mg/L;NAKT-MS+NAA 0.4mg/L+KT 0.8 mg/L。试验结果(表2)表明:植物生长调节剂浓度过低,茎段腋芽生长缓慢;浓度过高促使腋芽徒长,产生试管苗玻璃化现象。培养基内生物调节剂种类及浓度配比直接影响腋芽萌发和生长,接种在附加0.8 mg/L生长素和0.4 mg/L细胞分裂素的基本培养基上,茎段腋芽表现良好,玻璃化程度极轻,其中:附加生长素IAA的效果明显优于2,4-D和NAA,平均成苗率分别为71%、56%、56%,平均苗高分别为 1.65cm、1.15cm、1.0cm;附加细胞分裂素6-BA的效果较KT理想,平均成苗率分别为66.7%、55.3%,平均苗高分别为1.40cm、1.13cm。综合考虑细胞分裂素、植物生长调节剂种类和浓度配比,确定MS+IAA 0.4mg/L+6-BA 0.8mg/L+蔗糖30mg/L+琼脂 7.0mg/L为茎段腋芽萌发和生长的最适培养基。

表2 细胞分裂素、生长调节剂种类和浓度配比对腋芽萌发及生长的效应

3.3 增殖培养基优选及不定芽增殖培养

将丛生芽单芽的芽尖分别接种于MS、1/2MS和3/4MS培养基上,培养中均分别附加3个浓度IAA、6-BA、蔗糖,以及琼脂6.5 g/L。大量试验结果说明:基本培养基、生长素、细胞分裂素种类和浓度配比直接影响丛芽增殖,以植物生长素影响效果最大,且6-BA影响效果大于IAA。若细胞分裂素(6-BA)浓度高于1.2 mg/L,即会产生玻璃化现象。采用L9(34)正交试验设计和极差分析技术(表3)优化选择增殖培养基,由此可见,6-BA、IAA、基本培养基、蔗糖的极差(R)分别为2.4、2.0、0.68、0.62,对不定芽增殖影响效果由大至小顺序:6-BA﹥IAA﹥基本培养基﹥蔗糖。K值由大至小顺序:3/4MS﹥MS﹥1/2MS(基本培养基);0.5mg/L﹥0.3mg/L﹥0.7mg/L(IAA);1.0mg/L﹥0.8 mg/L﹥0.6 mg/L(6-BA);30 g/L﹥40g/L﹥20g/L(蔗糖),从而确定3/4MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5mg/L为不定芽最适增殖培养基。

表3 L9(34)正交试验设计和级差分析结果

3.4 生根培养和练苗移栽

3.4.1 生根培养。以MS、1/2MS为基本培养基,附加0.2 mg/L、0.4mg/L、0.6 mg/L浓度生根调节剂(IBA),设计6种生根培养基。转接高度适宜的试管苗至生根培养基上,经10 d暗培养后,转入光下培养。测定结果显示,基本培养基相同,附加IBA 0.4mg/L生根效果最佳,幼根数量及平均根长分别为8条/株(1/2MS)、6 条/株和 6.0 cm(1/2MS)、5.7 cm(MS);IBA浓度相同,植入1/2MS培养基,生根效果明显优于MS培养基,确定 1/2MS+IBA 1.4mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7 mg/L为最适生根培养基。

3.4.2 练苗移栽。在自然光条件下,掀开培养瓶的薄膜盖,培养15 d后,取出发育良好的生根苗,洗净根上附着的培养基,植入经0.5%KMnO4消毒的混合基质(河沙∶有机土∶腐熟鸡粪=1∶3∶1)中,浇透水,喷施多菌灵消毒,并加强光照,改善通风条件,翌年春季移入种质资源保存圃。

4 结论

4.1 樱桃李离体培养所需外植体必经严格消毒灭菌,且灭菌时间直接影响培养效果,以0.1%HgCl溶液表面灭菌6 min最理想,茎段污染率最低,褐化程度最轻。

4.2 在基本培养基(MS)中附加适当浓度细胞分裂素和植物生长调节剂质可有效诱导茎段离体再生,提高再生效率。樱桃李茎段腋芽萌发最适培养基为MS+IAA 0.4mg/L+6-BA 0.8mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L,植入此培养基,茎段腋芽诱导率最高。

4.3 基本培养基、植物生长素和细胞分裂素种类及浓度配比直接影响丛芽增殖,植物生长素影响效果显著,且6-BA影响效果大于IAA,通过正交试验和极差分析,筛选出丛芽最适培养基,即:3/4MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+蔗糖30mg/L+琼脂6.5g/L。

4.4 在基本培养基内附加 IBA,生根效果最佳,且IBA浓度相同,植入1/2MS培养基,生根效果明显优于MS培养基,确定1/2MS+IBA1.4mg/L+琼脂 7g/L+蔗糖30mg/L。

[1] 俞德浚.中国果树分类学[M].北京:农业出版社,1979:58-60.

[2] 张加延,周恩.中国果树志(李卷)[M].北京:中国林业出版社,1998:1-5.

[3] 陈正华.木本植物组织培养及应用[M].北京:高等教育出版社,1986:303-310.

[4] 刘崇琪.新疆野生樱桃李离体再生及其资源评价[D].泰安:山东农业大学,2008:5-17.

[5] 兰士波,田新华,李红艳.欧洲甜樱桃的组织培养与快速繁殖技术[J].中国园艺文摘,2010(10):27-28.