反相高效液相色谱法测定不同品种花椒中芦丁和槲皮素的含量

吴亮亮,石雪萍,张卫明

(1.南京野生植物综合利用研究院,江苏南京 210042;2.南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)

花椒 (Zan thoxylum bungeanum)属芸香科,全世界约有 250种,分布于亚洲、美洲、非洲及大洋洲的热带和亚热带地区。我国约有 45种,13个变种,主要品种为青椒 (Z.sch inifolium Sieb.et Zucc.)和花椒 (Z.bungeanum Maxim.)[1]。花椒中含有芦丁、槲皮素等数十种黄酮类成分[2]。黄酮具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等多种疗效[3]。芦丁又名芸香苷、紫槲皮苷,是槲皮素的 3-O-芸香糖苷,为一来源很广的黄酮类化合物,广泛存在芸香科植物中。芦丁和槲皮素是其主要活性成分,具有广泛的药理活性,开发前景广阔。黄酮的分析方法,已报道有分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法等[4-6]。目前中药材中黄酮的的主要测定方法主要是高效液相色谱法[7-9],为了综合开发花椒这种植物资源,掌握不同地区花椒中芦丁和槲皮素的含量,本实验首次建立了 RP-HPLC法同时测定花椒中芦丁和槲皮素含量的测定方法,并首次考察了不同产地的红花椒与青花椒上述 2种黄酮类成分的量,为花椒黄酮的后续研究提供依据。

1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪、二极管阵列检测器 (DAD)、安捷伦化学工作站、Zorbax保护住(H4033A)(安捷伦科技有限公司);JA 3103N分析天平 (上海明桥精密科学仪器有限公司)。T6新世纪紫外 -可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限公司)

样品:芦丁对照品、槲皮素对照品,均由中国药品生物制品检定所提供。甲醇、磷酸为 HPLC级,水为纯净水。其它试剂为分析纯。

花椒样品分别为韩城红花椒、四川青花椒、云南青花椒、茂汉红花椒,购于原料产地。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Zorbax Eclipse C18色谱柱 (150 mm×4.6 mm,5μm);流动相:甲醇 -0.4%磷酸 (50∶50);流速:1 mL/m in;检测波长:360 nm;柱温 25℃;进样量 5μL。

2.2 混合对照品溶液制备 精密称取 120℃干燥至恒重的芦丁标准品及槲皮素标准品各 50 m g,加20 mL 80%甲醇溶解,并继续用甲醇转移至 50 mL容量瓶中,定容至刻度,配成芦丁和槲皮素浓度均为1 mg/mL的混合对照品溶液。将此母液分别稀释1/2 、1/4、1/10、1/20倍 ,得 5个浓度梯度的对照品溶液。

2.3 样品溶液制备 将样品 60℃干燥,粉碎过 40目筛,精密称取样品粉末 2.0 g,精确加入 60%乙醇40 mL,超声波辅助提取 30 min,提取液滤过置 50 mL量瓶中,加乙醇定容至刻度。用 0.45μm的微孔滤膜滤过,即得。

2.4 线性关系考察 精密吸取 2.2节的混合对照品溶液 5μL进样,以色谱峰面积 (Y)对进样量 (X)进行回归,计算回归方程。结果见表1。

表1 芦丁和槲皮素的线性回归方程、相关系数和检出限

表1的结果表明芦丁和槲皮素混合标准溶液在上述浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取 2.2节的混合对照品母液 5μL,在上述色谱条件下,重复进样 5次,分别计算芦丁、槲皮素的峰面积 RSD值,芦丁 RSD为 0.61%、槲皮素 RSD为 1.32%,表明仪器进样精密度良好。

2.6 重现性试验 精密称取茂汉红花椒果皮粉末

5份,每份 0.5 g,照供试品溶液制备方法进行提取处理后,精密吸取 5μL在上述色谱条件下进行分析,计算峰面积的 RSD值,芦丁 RSD为 3.15%、槲皮素 RSD为 2.50%,结果表明使用该法处理样品的重现性良好。

2.7 稳定性试验 取供试样品 ,分别在 0、2、4、6、8 h测定芦丁、槲皮素的峰面积,结果表明芦丁、槲皮素在 8h内稳定性良好,RSD分别为 1.02%,2.13%。

2.8 加样回收率试验 精密移取样品液 200μL,3份。分别精密加入 2.2节的混合对照品母液 30、40、50μL混合,精密吸取 5μL。在上述色谱条件下进行分析,结果芦丁平均回收率 99.1%,RSD为4.3%。槲皮素平均回收率 111.2%,RSD为 5.1%。

2.9 不同花椒品种样品测定 取不同品种花椒各2 g,按供试品溶液制备项下处理,在上述色谱条件下进行分析,结果图1和表2。

图1 对照品 (A)和韩城花椒提取物 (B)色谱图

表2 不同花椒品种中芦丁、槲皮素含量测定

3 讨 论

3.1 花椒黄酮提取方法的确定 通过对冷浸提取、加热回流提取及超声波辅助提取的比较,确定用超声波辅助提取 30 m in效果较好。

3.2 检测波长的选择 将芦丁和槲皮素对照品溶液进行紫外分光光度计进行波长扫描,在 254 nm和360 nm处有两个吸收峰,鉴于低波长处杂质的干扰,本实验选用 360 nm作为检测波长。

3.3 流动相的选择 本试验先后选择了甲醇∶水(50∶50)及甲醇:0.4%磷酸水溶液,并且调节等体系作为流动相进行相关试验。试验表明不加磷酸的流动相对于样品中黄酮和杂质的分离度不够,不能有效的分离开来,且拖尾严重,加入磷酸可有效防止。且甲醇浓度过高,出峰时间短,分离度不好,甲醇浓度过低比例在 50∶50最合适。保证芦丁和槲皮素在 10 m in之内出峰,且和杂质峰有效分离。

3.4 对不同产花椒中芦丁和槲皮素含量的比较

从实验结果可以看出,反相高效液相色潽法测定花椒中芦丁和槲皮素的含量,方法稳定、可行。花椒中芦丁含量较高,韩城红花椒 >茂汉红花椒 >四川青花椒 >云南青花椒。槲皮素在韩城红花椒中含量明显高于其他三种花椒。综合考虑,红花椒比青花椒更适合花椒黄酮类成分研究。

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1981.

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