赖氨肌醇维B12口服溶液中赖氨酸与维生素B12含量测定

谢清春 吕竹芬

（广东药学院药物研究所，广东广州510006）

氨基酸是人体生命活动过程中不可缺少的一种物质，赖氨酸又是人体不能自身合成而又为机体所必须的8种氨基酸中最为重要的一种。赖氨酸可加快神经细胞代谢过程，提高脑组织的生理功能，增强记忆力[1]。维生素B12是人体内非常重要的水溶性维生素之一[2]，维生素B12缺乏时，从甲基四氢叶酸上转移甲基基团的活动减少，使叶酸变成不能利用的形式，导致儿童发育和神经功能受损等。营养性贫血目前仍为我国儿童时期的多发病，其发病率占儿科门诊的40%左右。补充赖氨酸维生素B12口服溶液可增进小儿食欲[3]，补充机体必需营养，改善小儿免疫功能。因此对赖氨肌醇维B12口服溶液进行质量标准研究对控制赖氨肌醇维B12口服溶的质量有着重要的意义。

1 仪器与试药

821型袖珍数字式pH离子计（中山大学电子厂），Dionex P680高 效 液 相 色 谱 仪，DiamonsilTMC18（5µm，250mm×4.6mm）色谱柱，混合磷酸盐pH缓冲剂（上海虹北试剂厂），氢氧化钠（AR，广州化学试剂厂），甲醛溶液（AR，广州化学试剂厂）。

盐酸赖氨酸对照品（色谱纯，上海康达氨基酸厂，批号：20020311），维生素B12对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100248-200201），自制赖氨肌醇维B12口服溶液（批号：20050608、20050610、20050612）。

2 方法与结果

2.1 盐酸赖氨酸含量测定

2.1.1 测定方法 按照赖氨肌醇维B12口服溶液标准[WS-10001-（HD-0482）-2002]中含量测定方法测定[4]。方法为：精密量取本品15mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取20mL，用NaOH滴定液（0.1mol/L）调节pH至7.0，然后加预先校正至pH=9.0的甲醛溶液14mL，再以NaOH滴定液滴定至pH为9.0，自加入甲醛溶液以后所消耗的NaOH滴定液（0.1mol/L）的每1毫升数即为赖氨酸所消耗的毫升数。每1毫升的NaOH滴定液相当于9.132mg的C6H14N2O2·HCl。

2.1.2 工作曲线的制定 精密称取盐酸赖氨酸对照品1.8g，置于200mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取16、18、20、22、24mL，照1.1项下的“用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）调节pH至7.0”开始操作测定，计算V（滴定液消耗量/mL）对G（盐酸赖氨酸的量/mg）的回归方程为V=0.1055G-0.3425，r=0.9996。

2.1.3 精密度实验 取批号为20050608的样品，精密量取6份，分别按1.1项下的方法测定其含量，测定结果为100.44%、101.15%、101.71%、101.31%、100.88%、100.76%，RSD% 为0.44%（n=6），精密度试验良好。

2.1.4 溶液稳定性试验 取批号为20050608的样品，于0、2、8、24、48、120h分别按1.1项下的方法测定其含量，结果分别为 101.12%、100.53%、102.15%、100.79%、101.55%、101.65%，RSD%为0.59%（n=6），溶液稳定性好。

2.1.5 回收率试验 按处方比例配制不含盐酸赖氨酸的阴性溶液，精密称取盐酸赖氨酸对照品0.72g、0.9g和1.08g（相当于含量的80%、100%和120%）置100mL量瓶中，加入阴性溶液到刻度，摇匀，照1.1项下方法测定。结果见表1，平均回收率为99.81%，RSD=0.46%，符合含量测定要求。

表1 盐酸赖氨酸含量测定的回收率试验

2.1.6 样品含量测定 精密量取本品15mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取20mL，照1.1项测定三批自制样品，结果表明自制三批样品（20050608、20050608、20050610）中盐酸赖氨酸含量分别为100.72%、99.45%和99.76%，均符合规定。

2.2 维生素B12的含量测定方法

2.2.1 对照液和供试液的配制 对照品溶液：精密称取维生素B12对照品10mg，置50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀得到浓度为200µg/mL标准储备液，精密量取此溶液3mL至200mL容量瓶中，加水稀释至刻度即得浓度为3µg/mL对照液。供试品溶液：取本口服液用0.45µm滤过，即得。

2.2.2 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠（16︰84）用磷酸调节pH=3.3为流动相，流速1mL/min，检测波长210nm。取维生素B12对照品溶液过0.45um滤膜滤后，精密量取续滤液20uL注入液相色谱议，记录色谱图。维生素B12的理论塔板数应大于800，不含维生素的B12的阴性对照对测定没有干扰。见图 1、2、3。

图1 标准品HPLC图

图2 样品HPLC图

图3 阴性对照HPLC图

2.2.3 线性关系考察 取维生素B12对照品适量用水制成每1mL 含 100µg的溶液的标准贮备液，依次吸取 0.5、1、1.5、2、2.5、3mL于50mL的容量瓶中，加水至刻度，摇匀，过滤，精密量取续滤液20µL注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，计算回归方程为A=0.8407C-0.0425，r=0.9998（n=6）。

2.2.4 精密度试验 取本品供试液20µL，注入液相色谱仪，连续进样6次，分别记录色谱图，计算进样的精密度，结果峰面积分别为2.422、2.414、2.432mAU×min，其RSD为0.99%，表明方法精密良好。2.2.5 溶液稳定性试验 取本品在室温下放置，定时取样测定，结果在 0、2、6、8、10、18、24h 峰面积分别为 2.453、2.471、2.434、2.475、2.405，2.435mAU×min，其 RSD 为 1.08%，表明溶液在24h内稳定。

2.2.6 最低检出限与定量限 按信噪比为3计算得最低检出限为0.12µg/mL，按10倍信噪比计算得最低定量限为0.40µg/mL。

2.2.7 回收率试验 按处方配比将维生素B12配制成2.4，3.0，3.6µg/mL三个浓度的溶液各100mL各3份，分别进样测定，结果见表2，平均回收率为98.80%，RSD为0.92%。

表2 维生素B12的回收率试验

2.2.8 样品测定 取本品适量，用0.45µm滤过，取续滤液备用照含量测定基下依法测定，按外标法以峰面积计算，结果20050608、20050610、20050612 含 量 分 别 为 100.81%、99.43%和98.25%，均符合规定。

3 讨论

原口服液标准中无维生素B12的含量测定，本文中的经验证表明可以用于本口服液的含量测定，可以进一步本品的质量。本文曾尝试衍生后用高效液相色谱法测定本品中肌醇的含量，但经多次试验表明衍生的结里重现不好，无法应用于肌醇的测定。本品中的盐酸赖氨酸无紫外吸收，尚不能通过高效液相的紫外检测法同时测定本品中盐酸赖氨酸与维生素B12。

[1] 陆志范，周全保 . 赖氨酸的药用功能[J]. 药学实践杂志，1966，14（4）：255.

[2] Weiss R，Fogelman Y，Bennett M. Severe vitamin B12 deficiency in an infant associated with a maternal deficiency and a strict vegetarian diet[J].J Pediatr Hematol Oncol，2004，26（4）：270-271.

[3] 王华芳，王招定，周海燕. 同笑口服液对小儿生长发育及免疫功能的影响[J]. 浙江医学，2006，28（10）：872-873.

[4] 国家药典委员会.国家药品监督管理局国家药品标准化学药品地方标准上升国国家标准第五册[S].2002：267.