釉基质蛋白与四环素联合应用对再植牙愈合的影响*

邢在臣 曹秀真 张古泉 曾国庆

(1.泰山医学院附属医院，山东，泰安 271000； 2.泰山医学院附属泰山医院，山东，泰安 271000)

临床上，牙齿因外伤脱落首选治疗方法是进行牙再植，植入后成功的关键是牙周膜再附着。对于干燥时间超过1小时的脱落牙齿，大部分牙周膜细胞已经坏死，仅有20%左右存活[1]，不经处理植入，大部分再植牙短期内会出现根吸收，最终脱落，因此，促进延迟再植牙残存的有活性的牙周膜细胞更有效地在根面上附着、增殖和分化是防止根吸收的重要措施，也是牙再植研究的重点。单独应用釉基质蛋白或四环素对再植牙的影响，国内外已经有研究。本实验试图通过釉基质蛋白联合四环素对延迟再植牙的牙根进行处理，从组织学观察其对延迟再植牙牙周再生的影响，为临床寻找一条能促进再植牙牙周纤维再附着、减少牙根吸收的有效方法。

1 材料与方法

1．1材料

1．1．1实验动物 健康成年杂种犬3条，雌雄不限，10～12月龄，体重9-10公斤 。选上颌双侧第1、 2牙和下颌双侧第2、 3牙为受试牙,共24 颗,随机分为实验组A、B和对照组,每组8 颗。

1．1．2实验材料

釉基质蛋白(EMDOGAIN)： 瑞典Biora公司盐酸四环素( 粉剂) 美国sigma, 用双蒸水将其配制成20g/L的溶液

1．1．3实验仪器

生物光学显微镜： 日本 Olympus公司生产根管治疗器械、拔牙手术器械与高速涡轮牙钻机、奥林派司光学显微镜 、组织切片机 、图文扫描仪、高清晰度彩色病理图文计算机分析系统

1．2方法

1.2.1根管处理

麻醉:以3%戊巴比妥钠按45mg/kg体重行腹腔麻醉； 根管充填:按常规方法处理,用牙胶尖与碘仿糊剂作根充,磷酸锌粘固粉垫底,玻璃离子封闭；治疗结束时肌注林可霉素0.6g，术后7d每日肌注林可霉素0.6g，分笼饲养，喂养软食。

1.2.2拔牙和再植

拔牙及干燥: 根管充填后一周,腹腔麻醉,取模，常规消毒,先用牙挺挺松受试牙,继续用牙钳握持牙冠旋转使之脱位；术中尽量减少对牙槽窝和牙根表面的损伤，将脱位牙搁置在经高温高压消毒的干燥木板上自然干燥1h；30min时,将牙翻身干燥另一面。

牙处理: 实验组A 8颗牙齿置于20g/L 的盐酸四环素溶液中浸泡5min，风枪吹干，牙根表面涂抹EMDOGAIN。 实验组B 8颗牙直接牙根表面涂抹EMDOGAIN。对照组不经过TET和EMDOGAIN处理。

牙槽窝处理：生理盐水冲洗牙槽窝以便去掉血块和碎屑，再植前两实验组牙槽窝均涂抹釉基质蛋白，对照组仅用生理盐水冲洗。

再植：将受试牙植入原牙槽窝中,印模对照，确保完全复位，用3-0可吸收缝线拢缝合近、远中牙龈做固定。术毕连续3d,每天给予林可霉素0.6g肌注一次。

饲养:分笼软食喂养。生理盐水清洗口腔 每日3次连续7天

取材：12周后,经腹腔内注射过量3%戊巴比妥钠,采用股动脉放血法处死实验犬。首先肉眼观察再植牙存留数量、牙龈愈合情况,接着取出前份上、下颌骨,按照实验牙位分别截成骨块。

1.2.3切片制作 将骨块置于10%甲醛中固定，5%甲酸脱钙，石蜡包埋，沿与牙体长轴垂直间隔500 μm片厚5 μm，伊红-苏木素染色。

1.2.4组织学观察 参考Andreasen 的方法[2],将牙根愈合的状况分为3 种类型: ①牙周膜性愈合:即牙骨质完整,周围组织无炎症,包括牙周膜愈合以及牙骨质无缺损而牙周膜被增生牙槽骨替代的两种情况； ②牙根炎症性吸收； ③牙根替代性吸收。对每颗牙的牙根观察9张切片。在盖玻片上划"米"字形的八等分线条,将此盖玻片覆盖在已作封闭处理的组织切片上。光镜下调整盖玻片,使其上两条互相垂直的线条分别通过牙根横断面的唇舌向轴与近远中向轴,且"米"字形的中心位于根管的中心。由此获得八等分线条与根面的8 个交点,此即每张切片的观察记录点。按照每观察点所属愈合类型，分类计数。先计算出每颗牙每一种牙根愈合类型的百分比, 即表明某一牙根愈合类型的观察点的总数除以每颗牙观察点的总数再乘100%。再计算各实验组与对照组每一种牙根愈合类型的百分比均数。

1.2.5统计学分析 采用样本均数差别的t检验的方法,各组间进行有关组织学类型的百分比均值的两两比较与分析

2 结 果

临床检查：所选择的24颗牙齿，无松动, 牙龈无充血、水肿或退缩

组织学观察：本实验观察牙根三种类型，牙周膜愈合：牙骨质完整无缺损, 包括愈合过程中始终无牙骨质吸收或先有吸收后得到修复的情况，牙周膜愈合是再植牙的理想愈合方式(图1)。炎性吸收：牙骨质及牙本质被吸收，炎性结缔组织侵入吸收区，吸收区内可见淋巴细胞、多核巨细胞等炎细胞浸润(图2)。 替代性吸收：牙周膜丧失牙骨质与牙本质被吸收, 吸收区内可见新牙槽骨形成(图3)。

图1 牙骨质无缺损, 牙周膜被增生牙槽骨替代(HE40)

图2 牙骨质与牙本质被吸收,炎性结缔组织侵入吸收区(HE40)

图3 牙骨质与牙本质被吸收, 吸收区可见新生牙槽骨(HE40)

由表1可见:(一)实验组A牙周膜愈合的百分比均值高于实验组B和对照组者,与对照组比较有高度显著性差异(P<0.01)，实验组A、B比较差异有显著性(P>0.05)。(二)实验组A牙根炎症性吸收的百分比均值低于实验组B和对照组者,有高度显著性差异(P<0.01)，实验组B和对照组差异无显著性(P>0.05)(三)各组间替代性吸收的百分比均值两两比较差异无显著性(P>0.05) 。

组别实验数牙周膜性愈合炎性吸收替代吸收实验组AEMDOGAIN+TEP828.92±7.605.52±3.8965.57±21.42实验组BEMDOGAIN820.75±6.6912.37±6.9466.89±19.81对照组812.36±5.1315.41±6.1772.24±18.02

3. 讨 论

关于试验牙齿的选择和根管治疗时机，实验选择上颌1、2牙以及下颌双侧第2、3牙为受试牙,因为这些牙均为单根牙,便于牙齿拔除，减少对牙槽窝的损伤，再者根管处理相对简单,试验前一周对受试牙根管治疗，排除再植后牙髓坏死感染引起牙根炎症性吸收，避免拔牙后进行根管处理时所造成的根面牙周膜的机械损伤，并且受试牙的离体和干燥时间更容易控制也更准确[3]。牙周膜愈合是再植牙的理想愈合方式，牙骨质愈合是指牙骨质完整无缺损,包括愈合过程中始终无牙骨质吸收或先有吸收后得到修复的情况。牙当干燥时间超过60 min时，根面存活的PDL (periodontal ligament, 牙周膜)细胞数量显著减少，再植后较少存在牙周膜愈合,牙周膜骨替代可以被认为是延期再植干燥牙经药物处理后愈合改善的一种组织学表现形式，本实验将两者都归类为牙周膜愈合。

釉质基质蛋白是在牙胚发育过程中由赫特威上皮根鞘分泌而成, 是一种特别的多功能生长因子, 它提供了一个特殊的细胞-基质相互作用的微环境[4]，影响细胞的多种生物学功能[5]，是一种能选择性促进牙周膜细胞再生的蛋白质, EMPs的主要成分是釉原蛋白, 在中性pH值和体温下是疏水的,应用后在根面区域能形成蛋白质聚集物,调节细胞-基质间的相互作用,通过促进细胞的增殖和分化, 从而促进受损牙周组织的再生[6]。EMPs通过促进PDL细胞增殖、提高PDL细胞分泌蛋白的总量、促进PDL细胞形成矿结节，PDL细胞在EMPs作用下的这三种变化直接有助于其对受损PDL的修复和再生。EMPs能优先刺激受损牙根面有活性的PDL细胞增殖、抑制上皮细胞增殖，当根周炎性反应消退后，这些增殖的PDL细饱以数量优势覆盖了根面，并进而形成无细胞性牙骨质、牙周韧带和牙槽骨，从而导致了牙周组织再生。本实验结果同样显示，应用EMPS的两实验组的牙周膜愈合百分数均值远高于对照组，差异有明显显著性。

四环素由于具有抗菌以及抑制破骨细胞与金属蛋白酶活性的作用,已被用于牙周病治疗的研究和再植牙的处理[7]。实验结果显示，采用EMPS和四环素联合应用的实验组A，牙根炎症性吸收百分比均数显著低于单纯使用EMPS实验组B和对照组。四环素溶液浸泡降低牙根炎症性吸收的机理在于, 四环素具有抗金属蛋白酶和破骨细胞活性的作用,致使牙根硬组织遭炎症吸收的过程可以被缩短或终止; 此外, 相对于全身应用而言, 四环素局部应用具有杀菌而非抑菌作用, 可以更加有效地控制细菌的繁殖, 从而削弱干燥牙再植后炎症反应的程度并缩短其持续时间。盐酸四环素还可使根面轻度脱矿, 胶原纤维暴露, 改变了根面的状态, 使根面的生物相容性提高, 使生长因子易于与其亲和，更有利于EMPs在牙周再生中发挥其最大的生物学效应,这种情况下使用生物因子EMPs, 能充分发挥EMPs对PDL细胞的调节作用，如果牙根根面有玷污层存在，则抑制生长因子的生物活性[8][9]。实验组A EMPs和四环素联合应用，其牙周膜愈合百分比高于单纯使用EMPs的实验组B，两者有高度显著性差异(P<0.01)，表明四环素与EMPS具有很好的协同作用，能很好的促进牙周膜的愈合。替代性吸收在两实验组和对照组间有差异，但没有统计学意义，分析原因，首先是因为局部应用四环素可通过抗菌作用在一定程度上减轻干燥牙再植后的炎症反应,但并不能完全制止非感染因素引起炎症反应，再者随着时间的延长，EMPS逐渐被降解，促进牙周膜的作用也逐渐消失。

综上所述，四环素和EMPS局部联合应用，应用能减少干燥再植牙炎性吸收、促进牙周愈合，有一定的临床价值，但有待进一步深入研究。

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