2，3-吲哚醌对小鼠PD模型黑质BAX基因表达影响*

张 芳 宋丽萍 朱秀丽 张继国 岳 旺

(1.青岛大学医学院药理学教研室，山东 青岛 266021；2.泰山医学院药理学教研室，山东 泰安 271016)

1982年，人们发现一些吸毒者注射了被1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-pheny-1，2，3，6-tetrahyrdropyridine，MPTP)污染的的毒品后出现了帕金森综合症[1]，从此MPTP作为一种神经毒素被人们所认识，MPTP有高度的亲脂性，虽然本身不具有神经毒性，但可以穿越血脑屏障，并主要在星形胶质细胞和5-羟色胺能神经元内的单胺氧化酶B作用下转变为有毒性的1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridium，MPP+)，然后释放到细胞外，经由多巴胺转运体(Dopamine transporter，DAT)进入多巴胺能神经末梢和胞体，选择性破坏黑质多巴胺能神经元，导致黑质细胞体、纹状体神经末梢多巴胺递质的大量减少[2]。

生命有机体的生长发育离不开细胞的增殖、分化和凋亡，BCL-2家族成员在细胞凋亡的基因调控过程中起着至关重要的作用，该家族可以分为两类：一类是抗细胞凋亡基因，代表基因是BCL-2基因；另一类是促细胞凋亡基因，代表基因是BAX基因，他们通过激活一系列下游基因发挥调节凋亡作用[3]。研究发现BAX蛋白水平与凋亡调控直接相关，BAX蛋白高表达决定细胞在受到凋亡刺激信号后趋于凋亡[4]。

2，3-吲哚醌(isatin，ISA)，又名靛红，是近年发现存在于人和动物体内的一种内源性活性因子，具有多种生物学活性。先前我们在多种动物模型证实ISA可提高脑内DA含量，减轻大鼠6-OHDA损毁模型的旋转行为[5]，然而有关其对脑内DA神经元的保护作用尚未见报道，为了探讨ISA对PD模型小鼠是否具有保护作用，本实验在C57BL/6J小鼠PD模型，检测黑质BAX基因的表达情况。

1 材料与方法

1.1动 物

健康雄性C57BL/6J小鼠，10-12w，体重21±2g，由北京维通利华动物实验中心提供，合格证号：scxk(京)2002-2003。置于室温19±2℃，12：12小时昼夜循环光照条件下生活，自由饮水、取食。动物于实验前适应实验室一周。

1.2仪器与药品

MPTP，美国Sigma公司产品，规格：100mg/瓶，批号：085k4616，纯度≥98%(HPLC)；ISA，北京化工厂生产，批号：I0080，纯度≥97.5%(T)；柠檬酸、柠檬酸钠：均为北京化工厂产分析纯。甲醇：山东禹王化工厂，色谱纯，多聚甲醛，山东禹王化工厂，用0.1 M磷酸盐缓冲液(PBS)配成浓度为4%的溶液，PH值为7.4。

电子天平：德国SARTORIUS产品。冰冻切片机：德国Leitz公司制造。2.5、10、20、200、1000 l微量加样器：德国Eppendorf产品。

1.3模型制作

C57BL/6J小鼠随机均分为5组，n=6：①NS 10 ml/kg，灌胃(ig)，连续10 d；② NS，10 ml/kg，ig，连续10 d；③ ISA 50 mg/kg ig，连续10 d；④ ISA 100 mg/kg ig，连续10 d；⑤ ISA 200 mg/kg ig，连续10 d；后四组于末次给药次日MPTP15 mg/kg腹腔注射(ip)，每隔2 h 1次，共四次；①组ip等体积NS。每次注射后观察小鼠行为变化。于末次注射MPTP 24 h后处死小鼠，灌注固定取脑。

1.4免疫组化染色

用水合氯醛将小鼠深度麻醉后，从左心室插管快速灌注37℃ NS 150～200 ml冲洗至小鼠肝脏发白，随即灌注4℃ 4%多聚甲醛约150 ml，至头与四肢已发硬。然后断头取脑，置于4%多聚甲醛，于4℃固定6 h，置入4℃20%蔗糖磷酸缓冲液内，脑块沉入瓶底后再移入30%蔗糖磷酸缓冲液，待脑块沉底后进行切片。

修整中脑组织块进行冠状连续冰冻切片，片厚16μm，载玻片预先用多聚赖氨酸铺被。进行BAX免疫组织化学染色。

从冰箱中取出脑片，晾干→放在玻璃片盒中0.3%甲醇溶液-H2O2溶液30 min(1 ml 30% H2O2+99 ml甲醇)→0.01 MPBS冲洗5 min×3次→加入抗原修复液，高火沸腾→低火10～15 min→室温冷却→擦干，滴加SABC中的A液，置37℃水浴温孵30 min(A液，蓝色)→0.01 M PBS稀释一抗→滴加一抗(每片约20μL)，4℃冰箱过夜(约12 h)时间可调整→0.01M PBS冲洗5 min×3→擦干，滴加二抗(黄色)，37℃水浴1 h(室温2 h或4℃过夜)→0.01 M PBS冲洗5 min×3→擦干。滴加SABC中C液(红色)→37℃水浴1 h，0.01 M PBS冲洗5 min×3次→DAB显色后镜下观察无新的阳性C出现时，0.01 MPBS冲洗(注：DAB有毒，现用现配，避光)

BAX染色进行吸光度值测定，切片拍照后simple PCI 软件分别测定SN区和皮层的吸光度值。按Franklin-Paxinos 编著的小鼠脑图谱，镜下辨认核团，用鼠标勾画图像相应核团边界。计算BAX特异性免疫反应结合率，即用SN区测得的吸光度值减去皮层非特异性染色的吸光度值为特异性染色，免疫反应结合率=特异性染色/非特异性染色，进行比较。

2 结 果

给予MPTP的各组小鼠均表现出运动障碍，动作迟缓，前肢抬举伴震颤、竖毛，对外界反映低下，短暂性活动减少等症状，经ISA 100 mg/kg、200 mg/kg预处理的小鼠，上述表现明显减轻。

2.1ISA对MPTP模型小鼠BAX免疫反应活性影响

BAX基因表达在黑质细胞的胞质。PD模型组BAX免疫组化染色灰度值明显高于对照组；经ISA100 mg/kg、200 mg/kg处理的PD组BAX免疫组化染色灰度值显著低于未经处理的PD组，且随着ISA剂量的增加灰度值减小(表1)。

表1 ISA对PD模型小鼠黑质BAX免疫组化染色灰度值的影响(n=6)

GroupSpecific grey levelControl4.35±1.4MPTP16.42±3.7*MPTP+ISA 50mg/kg14.49±2.3MPTP+ISA 100mg/kg12.33±2.2#MPTP+ISA 200mg/kg8.33±1.3#

*P<0.01, compared with Control；#P<0.05, compared with MPTP group

MPTP模型组与正常组对照组相比，黑质致密部特异性BAX免疫反应结合率显著增高；ISA 100 mg/kg、200 mg/kg组特异性BAX免疫反应结合率与MPTP模型组相比有明显地降低(图1)。

图 1 C57BL/6J小鼠黑质区BAX免疫组化照片(10×10)

1: control; 2: MPTP; 3: ISA 50 mg/kg+MPTP; 4: ISA 100 mg/kg+MPTP;5: ISA 200 mg/kg+MPTP

3 讨 论

本实验以MPTP作为损伤因素，造成小鼠PD模型进行研究。MPTP本身对神经元并无毒性，因其具有高度的亲脂性，外周给药很容易进入脑内，在胶质细胞的MAO-B催化，经短暂的中间代谢产物生成MPP+才对DA能神经元表现出选择性毒性作用[6]。MPP+进入DA能神经元后，被线粒体主动摄取而浓集，特异性抑制氧化呼吸链复合体I和电子传递，产生反应氧族和一氧化氮等导致黑质DA能神经元坏死，在多种动物中产生类似于PD的症状和病理改变，是目前常用的PD动物模型。

在黑质多巴胺能神经元凋亡过程的研究中，BCL-2和BAX成为抑制凋亡基因和促进凋亡基因是研究热点。BCL-2家族是多基因家族，它包括抗凋亡蛋白BCL-2和BAX以及促进凋亡基因BAX、BCL-Xs、Bad，双方的比值在细胞凋亡过程中起作用[7]。BCL-2蛋白是一种膜整合蛋白，存在于细胞的线粒体、核膜、内质网膜上；BAX蛋白是Otter等[8]在研究BCL-2等其他蛋白相互作用同时发现的，它有6个外显子，编码相对分子质量21000的BAX蛋白，在组织中广泛表达。当BAX同源二聚体形成，促进凋亡；当BCL-2蛋白表达增加，越来越多的BAX二聚体分开，与BCL-2形成更稳定的异源二聚体，中和了BAX二聚体诱导凋亡的作用，即细胞内BCL-2和BAX的比例调节了凋亡的发生。因此，可以通过观察BAX蛋白来观察ISA对PD模型小鼠的保护作用。

本实验结果显示，MPTP处理的小鼠SN内BAX免疫组化染色明显高于正常组，BAX表达水平明显增高，提示MPTP导致了DA能神经元大量变性坏死，小鼠表现出的前肢抬举伴震颤、竖毛及短暂性活动减少等症状，成功制备了PD的小鼠模型。在ISA 100mg/kg、200mg/kg预处理组，免疫组化结果显示SN内BAX蛋白表达水平降低，提示存活的DA能神经元数目增多，表现出对MPTP损伤的小鼠PD模型的保护作用。

因MPTP须首先经MAO-B催化代谢为MPP+，而后产生过氧化物导致黑质DA能神经元坏死，故对保护MPTP造成的神经元损伤可以通过两种途径：抑制MAO-B，或者减少过氧化物的量，减轻对神经元的氧化损伤[9]。ISA对MPTP导致的多巴胺能神经元损伤有明显的保护作用，其机制尚需进一步深入研究。

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