灯盏花素抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡＊

龚明玉，周晓慧，张 力，陈亚静

(1.承德医学院生化教研室，河北 承 德 067000;2.承德医学院附属医院放疗科，河北 承 德 067000)

冠心病是导致人类死亡的主要原因[1]。在急性心肌梗死后，采用溶栓治疗、经皮冠状动脉介入术(PC I)或冠状动脉旁路移植术(CABG)以早期恢复心肌再灌注是缩小梗死范围和改善临床转归的最有效方法。但动物模型研究提示，致死性再灌注损伤最多可占心肌梗死最终体积的50%[2]。研究发现，灯盏花素具有扩张血管、降低血液黏滞度、改善微循环、防治血栓形成的作用，可有效地预防氯化钡、肾上腺素过量所导致的心律失常[3]。本研究通过用大鼠在体心脏模拟临床缺血再灌注损伤病理变化，观察灯盏花素是否具有抗凋亡等保护心肌的作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 灯盏花素注射液(吉林龙泰制药股份有限公司)，TUNEL检测试剂盒(Roche公司)。β-actin、caspase-3兔抗鼠多克隆抗体(美国Santa公司)，BCA蛋白定量试剂盒(上海生工)。

1.1.2 动物 健康SD大鼠40只，体重220g±20g，雌雄各半(购自天津市山川红实验动物科技有限公司，许可证号scxk津2009-001)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 40只SD大鼠随机分为灯盏花素I组、灯盏花素II组、正常对照组和缺血再灌注组4组，每组10只。4组大鼠均制备心肌缺血再灌注模型，其中灯盏花素2个组大鼠于手术前1周分别腹腔注射不同剂量的灯盏花素(25mg·kg－1·d－1、50mg·kg－1·d－1)，连用7d;正常对照组和缺血再灌注组术前分别给予相应容积的生理盐水，时间同灯盏花素组。

1.2.2 心肌缺血再灌注模型的制备 10%乌拉坦腹腔注射麻醉(1ml·100g－1)大鼠，仰卧位固定，用针型电极插入大鼠四肢皮下记录标准肢体II导联心电图。于胸骨左缘3～4肋间切开胸壁，暴露心脏，在左心耳与肺动脉干之间结扎左冠状动脉前降支，同时在结扎线与血管之间穿一直径2mm、长5mm的硅胶管，结扎30min;然后剪断缝合线，取出硅胶管，再灌注2h，正常对照组仅分离前降支，但不结扎。

1.2.3 心肌细胞凋亡的TUNEL染色 ①按照试剂盒说明书操作如下:石蜡切片常规脱蜡，新配置的3%H2O2溶液室温放置10min以封闭内源性过氧化物酶(POD)，蛋白酶K(25μg/mL)37℃消化30min，加TUNEL混合液，湿盒37℃ 60min，加ulcon-POD，37℃30min，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。标记前用DNA酶处理切片做阳性对照，用标记液代替TUNEL反应液做阴性对照;②检测内容:阳性细胞核和(或)细胞碎片呈深浅不一的棕黄色，每张切片随机选取10个视野(×400倍)，记数凋亡阳性细胞，以凋亡指数(apoptosis index，AI)作为凋亡程度的指标。AI=(视野内凋亡细胞个数/视野内所有细胞个数)×100%。

1.2.4 蛋白印记法检测Caspase-3蛋白的表达

心肌组织蛋白提取，取心肌组织约100mg加入冰预冷的适量细胞裂解液，制成心肌细胞匀浆。冰上裂解40min，4℃12000rpm/min，离心20min收集上清，按照BCA蛋白定量试剂盒说明进行蛋白定量测定。采用蛋白印记法检测Caspase-3蛋白的表达，上样量90μg，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜上;一抗稀释浓度1∶200，ECL检测试剂盒显影、洗片。以β-actin(1∶200稀释)杂交作为内对照。胶片经扫描仪扫描后获得图像。用Bandleader 5.0软件进行灰度分析，计算目的蛋白条带与βactin的灰度比值。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 灯盏花素对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响

表1图1显示，TUNEL染色阳性产物位于细胞核，呈棕黄色颗粒状。缺血再灌注组的AI值显著高于对照组(P＜0.01)，灯盏花素I、II组的AI值低于缺血再灌注组(P＜0.05，P＜0.01)，说明灯盏花素可以抑制缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡。

2.2 Western blotting检测Caspase-3蛋白表达情况

表1 各组大鼠心肌细胞凋亡指数比较

表1 各组大鼠心肌细胞凋亡指数比较

注:与正常对照组比较:﹡﹡P＜0.01;与缺血再灌注组比较:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别 给药剂量(mg·kg－1·d－1)AI正 常 对 照 组 —4.24±0.96缺 血 再 灌 注 组 — 15.78±2.09﹡﹡灯盏花素Ⅰ组 25 13.97±1.98▲灯盏花素Ⅱ组 50 10.55±1.27▲▲

表2图2显示，与正常对照组大鼠相比，缺血再灌注组大鼠Caspase-3蛋白表达显著升高(P＜0.01);与缺血再灌注组大鼠比较，灯盏花素组大鼠Caspase-3蛋白表达明显降低(P＜0.05，P＜0.01)，差异具有显著性。

图1 灯盏花素对心肌缺血再灌注各组大鼠心肌细胞凋亡的影响(×400)

表2 灯盏花素对大鼠心肌细胞Caspase-3蛋白表达的影响

表2 灯盏花素对大鼠心肌细胞Caspase-3蛋白表达的影响

注:与正常对照组比较:﹡﹡P＜0.01;与缺血再灌注组比较:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别 给药剂量(mg·kg－1·d－1)灰度比值Caspase-3/β-actin正 常 对 照 组 —0.461±0.008缺 血 再 灌 注 组 — 0.711±0.016﹡﹡灯 盏 花 素 Ⅰ 组 25 0.697±0.014▲灯盏 花 素 Ⅱ 组 50 0.548±0.012▲▲

图2 灯盏花素对大鼠心肌细胞Caspase-3蛋白表达的影响

3 讨论

近年来，减轻心肌缺血-再灌注损伤一直是心脏病学应用基础研究中的一个热点课题。研究发现，心肌缺血再灌注过程可诱导细胞凋亡，细胞凋亡是MIRI的特征之一，并与心肌迟发性死亡关系密切，细胞凋亡的多少决定着缺血再灌注损伤的轻重[4、5]。冯全洲等[6]发现，在大鼠实验性心肌缺血后可引起细胞凋亡;赵明中等[7]在大鼠心肌缺血/再灌注时发现心肌细胞凋亡。细胞凋亡是受基因调控的有序的细胞非炎症性死亡，药物预处理干预心肌细胞凋亡被认为是预防和治疗再灌注损伤的一条新途径[8]。灯盏花素是从中药灯盏花中分离得到的黄酮类化合物，现代药理研究表明，灯盏花素具有扩张血管、改善微循环、抗凋亡等作用[9]。本研究结果显示，与正常对照组相比，缺血再灌注组的心肌细胞凋亡指数明显增加，灯盏花素组的心肌细胞凋亡指数较缺血再灌注组明显降低，表明灯盏花素具有抑制再灌注心肌细胞凋亡的作用。

细胞凋亡是由基因控制的主动性死亡过程，与某些凋亡相关基因的调节与表达有关。Caspase是一个特殊的蛋白水解酶家族，全称是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，其与心肌细胞凋亡的关系是近年来研究的热点之一。在众多Caspase成员中，Caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子激活的关键蛋白酶。Caspase-3引起DNA损伤修复酶降解，同时激活核酸内切酶，从而使细胞凋亡[10、11]。徐强[12]等研究大鼠再灌注不同时相Caspase-3激活与心功能变化的关系提出，Caspase-3激活是MIRI后心肌细胞凋亡导致心功能下降的机制之一。本实验通过对心肌细胞的Caspase-3蛋白表达水平的检测，显示缺血再灌注组的细胞Caspase-3蛋白表达明显增加，当给予大鼠灯盏花素后，心肌细胞Caspase-3蛋白表达明显下降。根据以上实验结果，提示灯盏花素可以抑制再灌注心肌细胞的凋亡而具有心肌细胞的保护作用，其作用机制可能是通过下调Caspase-3蛋白的表达来实现的。

[1]Yellon DM，Hausenloy DJ.Myocardial Reperfusion Injury[J].N Engl J Med，2007，357(11):1121-1135.

[2]吴锦波，吴平生，张宏斌，等.促红细胞生成素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护性作用[J].第四军医大学学报，2009，30(19):1894-1897.

[3]马 昆，李玉莲，张玉萍.灯盏花素的临床应用[J].医药导报，2003，6(22):79-80.

[4]Saeed SA，Waqar MA，Zubairi AJ，et al.Myocardial ischaemia and reperfusion injury:reactive oxygen species and the role of neutrophil[J].J Coll Physicians Surg Pak，2005，15(8):507-514.

[5]Kovacevic M，SimicO，Jonjic N，etal.Apoptosisand cardiopulmonary bypass.J Card Surg，2007，22(2):129-134.

[6]冯全洲，韦立新，易军，等.大鼠实验性心肌缺血后Fas、bcl-2的表达与心肌细胞凋亡的关系[J].中华病理学杂志，2004，33(2):151-154.

[7]赵明中，陈运贞，李媛嫒，等.大鼠心肌缺血/再灌注损伤心肌细胞凋亡与Fas、FasL基因表达的变化[J].中华心血管病杂志，2001，29(10):605-608.

[8]Zhao ZQ，Morris CD，Budde JM，et al.Inhibition of myocardial apoptosis reduces infarct size and improves regional contractile dysfunction during reperfusion[J].Cardiovasc Res，2003，59(1):132-142.

[9]褚剑锋，郑 锋.灯盏细辛注射液在心血管内科中的应用新进展[J].福建中医学院学报(增刊)，2005，15:44-46.

[10]爱 珍，张振宇，张元明.地塞米松对脑缺氧缺血新生大鼠细胞凋亡抑制蛋白mRNA及Caspase-3活性的影响[J].实用儿科临床杂志，2007，22(12):923-924.

[11]陈永香，吴国远.缺氧缺血对新生大鼠脑组织半胱氨酸蛋白水解酶激活因子蛋白表达的影响[J].实用儿科临床杂志，2008，23(2):131-132.

[12]徐 强，司良毅，张 红.大鼠心肌再灌注不同时相Caspase-3激活与心功能变化的关系[J].第三军医大学学报，2005，27(33):2338-2340.