黄芪多糖对内毒素诱导巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β及NO的影响＊

徐 荔，何小鹃，柴 旺，鞠大宏，吕爱平，喻长远△

(1.北京化工大学，北京 100029;2.中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京 100700;3.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

黄芪是常用的“扶正固本，补益中气”药物，其化学成分复杂，含有多糖、多种皂甙、黄酮以及氨基酸、亚油酸、生物碱等。其中黄芪多糖(Astragalus Polysaccharide，APS)是黄芪中含量最多、免疫活性最强的一类物质，具有增强机体免疫、扩张冠状动脉、改善心脏功能、增强抗氧化能力、防止脂质过氧化、改善肾脏功能、防止肝糖原减少、抗衰老等多种功能及药理功效[1～3]。本实验以人单核巨噬细胞系U937细胞为研究对象，采用体外培养方法，观察黄芪多糖对LPS诱导的U937细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β及一氧化氮(NO)的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

U937细胞(购自北京协和医院基础医学研究所细胞中心);RPMI1640培养基(美国Gibcol公司);胎牛血清(美国Gibcol公司);双抗(美国Sigma公司);脂多糖(lipoplysaccharide，LPS)(美国Sigma公司);佛波酯(Phorbolmyristateacetate，PMA)(美国Sigma公司);Human TNF-α Instant ELISA，Human IL-1β Instant ELISA试剂盒(美国eBioscience公司);Griess Reagent System试剂盒(美国Promega公司);黄芪多糖(天津赛诺制药有限公司，批号081201)。

1.2 仪器

CO2培养箱(美国Thermo公司);倒置相差显微镜(日本Olympus公司);酶标分析仪(美国Thermo公司);以上均为中国中医科学院中医基础理论研究所仪器。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 U937细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，于37℃，5%CO2培养箱中静置培养。

1.3.2 ELISA检测TNF-α、IL-1β含量 选对数生长期的U937细胞，用RPMI1640完全培养基调整细胞浓度至4×105/ml接种于24孔板，每孔1ml，加PMA诱导48h成熟后，吸弃全部上清液，实验组每孔加入1ml LPS(1μg/ml)，另设对照组加入1ml RPMI1640培养基，置于37℃5%CO2的培养箱中作用1h后，实验组加入不同浓度的APS 200μl，使其终浓度为37.5μg/ml～150μg/ml，不加APS的LPS组及对照组每孔加入200μl PBS，置37℃5%CO2培养箱继续培养。24h后收集各组细胞上清液，采用酶联试验免疫吸附(ELISA)实验，测定各组细胞上清液中TNF-α，IL-1β的含量。方法均按ELISA试剂盒说明书进行，于酶标仪上测定450nm时的吸光度值。每孔设3个复孔，取平均值。

1.3.3 NO含量 选对数生长期的U937细胞，用RPMI1640完全培养基调整细胞浓度至4×105/ml接种于24孔板，每孔1ml，加PMA诱导48h成熟后，吸弃全部上清液，实验组每孔加入1ml LPS(1μg/ml)，另设对照组加入1ml RPMI1640培养基，置于37℃5%CO2的培养箱中作用1h后，实验组加入不同浓度的APS 200μl，使其终浓度为37.5μg/ml～150μg/ml，不加APS的LPS组及对照组每孔加入200μl PBS，置37℃5%CO2培养箱继续培养。24h后收集各组细胞上清液，采用Griess检测法测定各组细胞上清液中NO的含量。方法均按NO试剂盒说明书进行，于酶标仪上测定540nm时的吸光度值。每孔设3个复孔，取平均值。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 U937细胞经PMA诱导成熟

图1显示，常规培养的U937细胞为悬浮细胞，将其培养在含有10ng/mlPMA的培养基中，48h后90%细胞贴壁，从悬浮生长变为贴壁生长，并呈典型的巨噬细胞形态。

2.2 APS对LPS诱导的U937细胞产生TNF-α的影响

图1 PMA诱导U937成熟(40×)

表1显示，LPS作用于PMA诱导的U937巨噬细胞后，细胞上清液中的 TNF-α含量明显增加，与对照组比较，具有显著差异(P＜0.01)。APS各浓度组细胞上清液中的TNF-α含量明显低于 LPS组(P ＜0.05)，其中当 APS 终浓度为 75μg/ml和150μg/ml时，细胞上清液中的TNF-α含量显著低于LPS组(P ＜0.01)。

表1 APS对LPS诱导的U937细胞产生TNF-α的影响

2.3 APS对LPS诱导的 U937细胞产生 IL-1β的影响

表2显示，LPS作用于PMA诱导的U937巨噬细胞后，细胞上清液中的IL-1β含量明显增加，与对照组比较，具有显著差异(P＜0.05)。APS各浓度组细胞上清液中的IL-1β含量明显低于LPS组(P＜0.05)，其中当 APS终浓度为 75μg/ml和 150μg/ml时，细胞上清液中的 IL-1β含量显著低于 LPS组(P ＜0.01)。

2.4 APS对LPS诱导 U937细胞产生NO影响

表3显示，LPS作用于PMA诱导的U937巨噬细胞后，细胞上清液中的NO含量明显增加，与对照组比较，具有显著差异(P＜0.01)。APS各浓度组细胞上清液中的 NO含量明显低于 LPS组(P＜0.01)。

表2 APS对LPS诱导的U937细胞产生IL-1β的影响

表3 APS对LPS诱导的U937细胞产生NO的影响

3 讨论

黄芪是常用的益气健脾中药之一，黄芪多糖是黄芪的一种重要的单体成分。黄芪多糖是一种免疫调节剂，可以调节机体的免疫功能，从而增强机体抗炎和抗病毒效应。本研究首先检测了黄芪多糖对U937细胞活力的影响，确定对U937细胞活力影响不明显的浓度范围，进行后续正式实验。结果表明，黄芪多糖浓度为 37.5μg/ml～150μg/ml时对 U937的活力影响不明显(数据未列出)，因此我们采用该浓度范围内(37.5μg/ml～150μg/ml)的黄芪多糖进行后续实验研究。

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，具有抗肿瘤、抗感染和免疫调节等重要作用，在固有免疫应答中发挥重要作用，并参与特异性免疫应答[4]。正常情况下，巨噬细胞通过吞噬异物、细菌、衰老和突变细胞以维持机体的免疫稳态，同时活化的单核巨噬细胞能分泌大量的趋化因子和炎症因子，参与机体固有和获得性免疫调节[5]。近年来的研究表明，活化的巨噬细胞产生近百种的活性物质，如 TNF-α、IL-1β、NO等，其中许多与免疫应答及炎症有关。TNF-α和IL-1β等为前炎症细胞因子或早期细胞因子，是启动炎症反应的关键细胞因子。TNF-α是机体应激反应产生最早的炎症介质，起最核心的作用[6]。TNF-α的出现能诱发机体代谢和血流动力学明显变化，促进炎症介质生成。IL-1β主要存在于血循环中，能诱导出与 TNF-α相似的生理和代谢改变，且能与TNF-α产生相互协同作用引起血管扩张和白细胞介导的组织坏死，从而导致器官衰竭[7]。NO广泛分布于生物体的各组织器官，参与机体多种重要的生理病理活动。最新的研究表明，NO具有广泛的免疫学意义，其作为炎症介质参加体内免疫应答反应[8]。本实验利用 LPS体外诱导巨噬细胞产生炎症因子并使用黄芪多糖干预，观察黄芪多糖对LPS诱导巨噬细胞产生炎症因子的影响。结果表明，黄芪多糖能够显著降低LPS诱导巨噬细胞产生的TNF-α、IL-1β及 NO，提示黄芪多糖可能用于炎症等相关疾病的治疗。

[1]蔡 莉.黄芪多糖研究现状与进展.中国肿瘤临床，2007，3(15):896-899.

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[4]Katsiari C G，Liossis S N，Sfikakis P P.The pathophysiologic role of monocytes and macrophages in systemic lupus erythematosus:A reappraisal.Seminars in Arthritis and Rheumatism，2009，1(14):1-13.

[5]曲芸芸，马春燕，朱 敏，等.免疫复合物对单核巨噬细胞的调节作用.山东大学学报(医学版)，2010，48(4):54-58.

[6]秦 爽，贺育兰，杨 静，等.重组人生长激素对内毒素诱导人巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β含量的影响.中国感染控制杂志，2008，7(1):9-11.

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