不同处理方式对红松愈伤组织诱导及增殖的影响

曹 焱 戴伟男 戴凤海

(1.黑龙江林业科学研究所，哈尔滨 150081；2.黑龙江省林木种苗管理总站，哈尔滨 150090)

红松(Pinuskoraiensis)合子胚愈伤组织诱导是红松离体再生研究的前期准备，也是通过体细胞胚胎发生途径进行植株再生的重要基础。笔者经过大量试验，诱导出形态各异的红松愈伤组织，可旺盛增殖，但绝大多数最终不能分化出具有胚性感受态的细胞组织，因此有效愈伤组织的增殖与更新则成为针叶树体细胞胚胎发生的一个关键环节[1]。根据Arm strong标准将得到的愈伤组织分为3类：I型，结构致密、复杂多样、生长缓慢，通过器官发生途径分化芽和根，产生胚状体较少，不易长期继代；Ⅱ型，结构松散、易碎、呈颗粒状、生长较快，长期继代仍有胚性，能通过胚状体途径再生；Ⅲ型，结构粘软、水浸状、白色透明或半透明，容易继代培养，但几乎丧失分化能力，为非胚性愈伤组织[2]。试验中，我们根据Arm strongⅡ型愈伤组织的标准，来辨识哪些是有效愈伤组织，并对此进行继代培养。

1 材料和方法

1.1 材料

取红松成熟种子，采种地点为黑龙江省哈尔滨市阿城区小岭林场。红松人工林树龄30a左右，现已结实7a。采种后置于4℃冰箱低温保存4周后进行接种。

1.2 方法

1.2.1 接种前材料处理

接种完整外植体前，将灭菌后的合子胚分别放置于蔗糖溶液(10、20、30、50、70g·L-1)、PEG 6000(50、70、100、200、450 g·L-1)、甘露醇水溶液(0.5、1、2、4、8mmol·L-1)浸泡处理24h后接种。比较不同处理对愈伤组织诱导的影响。

1.2.2 培养基中不同蔗糖浓度处理

其他条件不变，取愈伤组织小块置于蔗糖浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%的培养基中。观察不同蔗糖浓度对愈伤组织增殖的影响。

1.2.3 添加ABA、PEG、甘露醇处理

在红松愈伤组织增殖培养阶段，研究ABA、PEG 6000和甘露醇对愈伤组织及有效愈伤组织增殖的影响。分别添加1、3、5、10、25g·L-1ABA；10、15、20、40、70 g·L-1PEG 6000；0.5、1、2、5、10g·L-1甘露醇。

所有处理均设3次重复，每个培养皿3～10个外植体，室温23～25℃，湿度大于60%。暗培养。4～6周继代一次。

1.2.4 数据获得及统计分析方法

试验中获得的各种愈伤组织均用解剖镜观察外部形态，并记录、拍照。试验数据采用Excel 和SPSS软件进行方差分析和差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 接种前处理对红松愈伤组织诱导的影响

接种之前，将灭菌后的完整胚分别置于各浓度的甘露醇溶液(M)、PEG 6000溶液(PEG)和蔗糖溶液(Su)中，浸泡24h后，取出外植体均接种于LM基本培养基添加2mg·L-12,4-D、0.5mg·L-16-BA、0.5mg·L-1TDZ。起初的2周内外植体无愈伤组织产生，整个外植体变白并膨大，15d后逐渐产生愈伤组织，形态多为疏松水渍状，无色透明或半透明。45d愈伤大量分化，在没更换培养基的情况下，60d仍能保持鲜活的状态，褐化率极低。据此推断，经过甘露醇、PEG 6000和蔗糖溶液处理的合子胚，其表面或内部细胞在外部物质的刺激下排列上发生变化，可以使得外植体几乎处在同一时间脱分化，并在很大程度上减少了褐化率，放慢了褐化速度。后期培养发现，甘露醇处理好于PEG 6000和蔗糖溶液处理。综合得出：对外植体进行甘露醇、PEG 6000和蔗糖溶液浸泡处理，均可以明显提高愈伤组织的初始分化率和诱导量，并可以相对长时期保持愈伤组织的旺盛分化能力。

2.2 培养基中不同蔗糖浓度对红松愈伤组织增殖的影响

蔗糖浓度不只对细胞增殖起作用，同时也是影响细胞分化的因素之一。将产生的红松愈伤组织分小块(直径0.5～1cm)接种于添加0.5mg·L-12,4-D、0.2mg·L-16-BA的LM培养基中，分为1%、2%、3%、4%、5%的蔗糖浓度，以蔗糖浓度为3%的处理作为对照，继代30d左右观察增殖效果，试验结果如图1。不同蔗糖浓度对有效愈伤组织的增殖和保持能力不同，但差异不显著(p<0.05)，说明蔗糖浓度对有效愈伤的增殖率影响不大。从增殖出的有效愈伤组织的外部形态来看：蔗糖浓度3%的处理产生的愈伤组织为浅黄色疏松、鲜活状，有的还产生瘤状小凸起，分化比较旺盛；蔗糖浓度在1%、2%时，表面产生细胞颗粒或绒毛状细胞，这是营养供应较差、碳源供应不足的表现；蔗糖浓度在4%时增殖率偏低，原有愈伤组织转变为团块状并且开始干燥，表明此种渗透压过大，培养物吸收营养物质较为困难；蔗糖浓度在5%时，原愈伤组织褐化后重新分化出具有鲜活特性的有效愈伤组织，这表明在愈伤组织受到高渗透压胁迫时，褐化的愈伤组织内部聚集了一定的活性物质，通过能量的转化后产生新的有效愈伤组织，但这种变化发生的频率较低。高渗透压下外植体新陈代谢加快，导致大部分的愈伤组织褐化死亡。综合看来，蔗糖浓度为3%的培养基对有效愈伤的增殖比较稳定。

2.3 培养基中添加ABA、PEG和甘露醇对红松有效愈伤组织增殖的影响

ABA、PEG 6000和甘露醇被认为具有促进胚性愈伤组织诱导和增殖的作用，可以延缓甚至减少外植体所受胁迫的危害。以LM为基本培养基，不添加其他激素，将诱导出的愈伤组织分别继代于添加1、3、5、10、25 g·L-1ABA，10、15、20、40、70g·L-1PEG 6000，0.5、1、2、5、10g·L-1甘露醇的各处理中，空白LM培养基作为对照，继代30d后观察增殖效果。

对照的有效愈伤增殖率为6.5%±4.2%。图2～图4分别显示了添加不同活性物质后对有效愈伤组织增殖的作用效果。从图中可明显看到，添加了5g·L-1ABA的处理与对照及其他处理差异极显著(p<0.01)，有效愈伤增殖率也为所有处理中最高，这表明5g·L-1ABA为较适宜的浓度。PEG 6000在10、15g·L-1时与对照差异显著(p<0.05)，有效愈伤增殖率达到25%～26%，随着PEG 6000浓度逐渐升高，有效愈伤组织增殖率急速下降，这表明PEG 6000浓度偏大，不适宜有效愈伤的诱导增殖，建议选在PEG 6000浓度为10～15g·L-1时增殖效果较好。甘露醇在0.5g·L-1时有效愈伤增殖率为显著水平(p<0.05)，随着浓度逐渐升高，先是急速下降，而后缓步上升，并趋近平稳，这表明应加入低浓度的甘露醇促进有效愈伤的增殖。

3 讨论

3.1 接种前处理与有效愈伤组织的诱导

本试验中经过蔗糖溶液、PEG 6000和甘露醇浸泡处理24 h的合子胚，在诱导过程中显示出了不易褐化并且旺盛分化的效果。试验中三种处理的外植体诱导率都达到了相当高的水平，说明经过处理的外植体其表面或内部结构发生了变化，对外界的刺激变得敏感，有利于愈伤组织的诱导。但到继代培养的后期，愈伤组织虽增殖迅速，却未见胚状体的发生，因此对其是否能促进胚性愈伤组织的发生还需继续探索。

3.2 蔗糖浓度与有效愈伤组织的增殖

在植物组织培养中蔗糖能支持大多数离体培养物的旺盛的生长，以至大多数合成培养基均以蔗糖作为唯一的碳源。因此，蔗糖的用量不仅影响培养物生长的速度和生长量，而且影响其代谢水平，次生代谢物的合成以及细胞形态和发生，是影响植物组织培养成功的关键[3]。本研究表明，当蔗糖浓度为2%时，有效愈伤组织诱导率最高，但有效愈伤组织不容易保持，容易在表面产生绒毛状细胞；当蔗糖浓度高达5%时，在一定的培养时间内有效愈伤组织迅速增加，培养基中营养元素耗费加速，外植体新陈代谢加快，从而导致培养物迅速褐化；而当蔗糖浓度在3%时，有效培养物可保持较长时间，并不断分化。由此可见，蔗糖浓度对提高有效愈伤组织的诱导频率以及形成高质量的培养物尤为关键。

3.3 ABA、PEG和甘露醇与有效愈伤组织的增殖

本试验中，添加了5g·L-1ABA的增殖培养基产生的有效愈伤达到极显著水平，说明ABA可以促进有效愈伤组织的产生。PEG在10～15g·L-1的范围也与其他浓度的诱导率达到显著水平。之前曾说PEG有促进愈伤组织分化、刺激细胞生长、调节细胞状态等优点，本试验的结果验证了这一理论。甘露醇只在0.5g·L-1的水平下，有效愈伤增殖达到了显著水平。这表明，在愈伤组织的增殖培养中，添加适当浓度的具有调节细胞势、渗透压等的物质可提高愈伤组织的增殖率。

4 结论

接种红松成熟合子胚之前，用蔗糖、PEG、甘露醇等高渗透压的物质浸泡种子更有利于愈伤组织的诱导以及使产生的愈伤组织活性延长。红松有效愈伤组织增殖阶段，蔗糖浓度与一般树种对碳水化合物的需求基本相同，最佳为3%；在培养基中加入适量的高渗透压物质，可以促进红松有效愈伤组织的增殖。

[1]王伟达,李成浩,杨静莉,张含国.不同植物生长调节物质对杂种落叶松胚性愈伤组织增殖的影响[J].东北林业大学学报，2008,(9):5～7.

[2]曹昆,李霞.木本植物组织培养不定芽诱导研究[J].江苏林业科技，2008,(10):43～48.

[3]Flowler MW, Wastson Rlyons. In Proc.5th Ind. Cong[M].Plant Tissue and Cell Culture,1982：225～228.