不同产地五鹤续断的同工酶研究

何娜娜，李 慧，王东辉，匡华琴，吴 敏，陈冬冬

(湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)

道地药材五鹤续断是一种常用中药，它是川续断科植物川续断(Dipsacusasperwall.)的干燥根，具有补肝益肾、续筋接骨、通血脉的功效.其性苦、辛、微温，用于腰膝酸软、风湿 痛、崩漏经多、胎漏下血、跌打损伤等.续断中含有挥发油、生物碱、多糖、蛋白质和多种重金属离子等主要有效成分.五鹤续断产量高，市场需求量大，临床应用范围广，开发前景好，但目前续断品种杂，不同产地的续断形态差异较大[1]，因此很有必要对五鹤续断进行更深入的研究.

目前，对续断植物的研究主要有品种考证[2]、栽培种植[3]、生物学特性[4]、药理作用[5]、临床应用[6]、质量辨别[7]、有效化学成分的分离[8]等.而同工酶分析技术广泛应用于中药材亲缘关系及道地性研究中[9].同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶，是基因表达的直接产物，在很大程度上能反映植物个体的遗传差异.同工酶结构的相似性反映了生物间的亲缘关系，酶谱资料可以作为鉴定物种，研究分类、进化、遗传和变异的重要参数[10].其中过氧化物酶是由单基因决定的同工酶，具有物种、组织器官和发育阶段的特异性，在一定程度上能较好的反映不同种源间的遗传差异.超氧化物岐化酶是一种与氧环境有关、具有清除氧自由基能力的酶[11-12].故本试验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离续断叶片中过氧化物酶和超氧化物歧化酶同工酶，比较电泳后的谱带来分析不同产地续断的亲缘关系，为续断植物的分类、选育及遗传研究提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

采自建始县龙坪、利川市元堡、恩施市鱼塘坝上坝、恩施市鱼塘坝硒矿区、巴东县绿葱坡、恩施市双河、鹤峰县太平乡、鹤峰县五里坪地区8个产地的五鹤续断.

1.2 实验仪器

电子天平，DYY-10C型垂直电泳槽及电泳仪(北京六一仪器厂)，飞鸽牌GL-16G-II高速冷冻离心机(厂家)，SZ-93自动双重纯水蒸馏器(厂家).

表1 聚丙烯酰胺凝胶配制表

1.3 试剂的配制和准备

1)30%Acr-0.8%Bis贮液：称取30 g丙烯酰胺(Acr)和0.8 g甲叉双丙烯酰胺,置于洗净烘干的烧杯中，加50 mL重蒸水溶解,搅拌,最后用重蒸水定容至100 mL，盛于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存.

2)分离胶缓冲贮备液(3 mol/LTris-HCl pH8.8)：称取18.2 gTris，加40 mL重蒸馏水溶解，再用 1 mol/L HCl调至pH=8.8，然后定容至100 mL，盛于棕色瓶中，4℃保存.

3)浓缩胶缓冲贮备液(0.5 mol/L Tris-HCl pH6.8)：称取6.7 gTris，加30 mL重蒸馏水，再用1 mol/L HCl调至pH=6.8，然后定容至100 mL，盛于棕色瓶中，4℃保存.

4)10%的过硫酸铵(10%Ap)：称取0.5 g过硫酸铵溶于5 mL重蒸馏水.使用时现配现用.

5)电极缓冲液 (0.25 mol/LTris，1.92 mol/L甘氨酸，pH8.3)：称取3 gTris 和14.4 g甘氨酸溶解在50 mL蒸馏水中，用浓盐酸调节pH值至8.3，用重蒸馏水定容至1 000 mL ,盛于棕色瓶中，保存在4℃冰箱中备用.

6)样品提取液A(0.05 mol/L Tris-HCl pH8.0)： 称取0.6 gTris，与30 mL 0.1 mol/L HCl混匀，调节pH值至8.0，加水稀释至100 mL.

7)样品提取液B(0.05 mol/L 磷酸缓冲液 pH7.8)：含1%PVP(聚乙烯吡咯烷酮).

8)样品处理液(40%Gly-0.1%溴酚蓝溶液):称取0.1 g溴酚蓝,甘油40 mL，加蒸馏水溶解，定容至100 mL，盛于棕色瓶中，保存在4℃冰箱中备用.

9)TEMED溶液：直接用原液.

1.4 试验方法

1.4.1 样品处理 分别称取8个地区续断新鲜叶片0.2 g，放入事先冰浴的研钵中，加入1 mL样品缓冲液(POD同工酶样品提取液用缓冲液A 0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.0，SOD同工酶样品提取液用样品提取液B 0.05 mol/L 磷酸缓冲液 pH7.8).研磨后将匀浆全部转入离心管，配平后放入4℃离心机10 000 r/min离心15 min，取上清液冷藏待用.

1.4.2 凝胶制备 分离胶制备经过反复实验对比，确定浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度POD同工酶为9%，SOD同工酶为10%，配方如表1.

1.4.3 染色方法 POD同工酶采用醋酸联苯胺法：称取0.1 g联苯胺，加少量无水乙醇溶解，依次加5 mol/L HAc 10 mL，1.5 mol/L NaAc 10 mL，H2O 70 mL ，最后加入3～5滴H2O2.将此显色液倾入培养皿中，待电泳凝胶片加入后不断搅动.常温下染色5 min，显色完毕用蒸馏水清洗数次，7%醋酸固定.数码相机照相.SOD同工酶的染色先将电泳好的凝胶浸入含有0.24 mmol/L NBT和0.28 mmol/L核黄素的pH7.8、50 mmol/L的磷酸缓冲液中，暗中反应20 min；取出后再浸入含有28 mmol/L TEMED(Mr:116.2)的pH7.8、50 mmol/L的磷酸缓冲液中，光下(600Lx)显色，直至凝胶上呈现出无色的SOD同工酶条带时照相.

1.4.4 结果计算 酶带迁移率(Rf)=酶带迁移距离/溴酚蓝迁移距离.

相似系数计算公式：S=2w/ (a+b).其中S为相似系数；w为2个品种相同的条带数；a、b分别为2个品种各自的条带数.

聚类分析：根据同工酶谱带的迁移率(Rf)，利用NTSYS 2.10e软件进行计算，得到聚类分析图.

1，建始县龙坪；2，利川市元堡；3，恩施市鱼塘坝上坝；4，恩施市鱼塘坝硒矿区；5，巴东县绿葱坡；6，恩施市双河；7，鹤峰县太平乡；8，鹤峰县五里坪.图1 POD同工酶酶谱Fig.1 The map of POD isozymes

图2 续断聚类分析图(POD)Fig.2 Dendrogram by cluster analysis of Dipsacus asper

2 结果与分析

2.1 不同产地续断的过氧化物酶酶谱分析

2.1.1 过氧化物酶POD电泳图像 图1中电泳图谱分别代表了五鹤续断根径叶中POD同工酶谱带，不同产地续断的酶带各有不同.供试材料共显示出5条谱带，从负极到正极依次编号为Rf1～Rf5.Rf值在0.35～0.55之间，其中Rf2为除了5号材料外，其他材料共有的谱带，可作为续断在过氧化物同工酶谱上的特征酶带.在8份供试材料中，1号(建始县龙坪)和3号(恩施市鱼塘坝上坝)所显示的酶谱完全相同且酶带最多，有4条；5号(巴东县绿葱坡)所显示的酶带最少，仅有1条.

2.1.2 相似系数分析 计算不同产地续断过氧化物酶酶带迁移率(Rf)，结果如表3；以及8个不同续断产地类型酶谱间相似系数，结果如表4.

表3 8个产地续断过氧化物酶同工酶酶谱Rf值

Tab.3Rfvalues of peroxidese isozeymes ofDipsacusfrom eight origins

样品编号Rf1Rf2Rf3Rf4Rf510．3500．405—0．4550．5502—0．405———30．3500．405—0．4550．55040．3500．405—0．455—5——0．445——6—0．405———70．3500．405—0．455—8—0．4050．445——

表4 8个不同品种续断酶谱间相似系数(POD)

Tab.4 Similar coefficient of isoenzyme bands ofDipsacusasperin eight

品种编号1234567811．00020．4001．00031．0000．4001．00040．8570．50．8571．000500001．00060．4001．0000．4000．50001．00070．8570．5000．8571．00000．5001．00080．3330．6670．3330．4000．6670．6670．4001．00

由表4可见，8份供试材料相似系数最大的为1(1号和3号；2号和6号；4号和7号)；相似系数最小的为0.相似度越大，说明物种间的酶谱差异越小，物种间关系越密切，反之则说明差异越大.5号除了与8号的相似系数为0.667，与其他材料的相似系数都为0，说明了5号(巴东县绿葱坡)与其他地区续断差异性最大，亲缘关系较远.

2.1.3 遗传距离及聚类分析 根据相似系数的聚类结果表明，在聚类距离0.680左右，8份续断材料可以分为3大类.第一大类包括建始县龙坪、恩施市鱼塘坝上坝、恩施市鱼塘坝硒矿区、鹤峰县太平乡；第二大类包括利川市元堡、恩施市双河、鹤峰县五里坪；第三类只包括巴东县绿葱坡的材料.说明了巴东县绿葱坡的续断材料与其他地区的差异性最大.

2.2 不同产地续断的超氧化物酶酶谱分析

2.2.1 超氧化物的SOD电泳图谱 图3中电泳图谱分别代表了五鹤续断SOD同工酶谱带，不同产地续断的酶带各有不同.供试材料共显示出4条谱带，依次编号为Rf1～Rf4.Rf值在0.167～0.667之间.2号、3号、4和5号材料的谱带都为2条，Rf值较为接近.6号、7号和8号材料的谱带都为4条，1号材料为3条谱带.

图4 续断聚类分析图(SOD)Fig.4 Dendrogram by cluster analysis of Dipsacus asper

1，鹤峰县五里坪；2，利川市元堡；3，恩施市双河；4，建始县龙坪；5，恩施市鱼塘坝硒矿区；6，鹤峰县太平乡；7，巴东县绿葱坡；8，恩施市鱼塘坝上坝.图3 SOD同工酶酶谱Fig.3 The map of SOD isozymes

2.2.2 相似系数 计算不同产地续断超氧化物岐化酶的Rf值，如表6.据表6 Rf值计算再得酶谱间相似系数,如表7.

表6 8个产地续断超氧化物歧化酶同工酶酶谱Rf值

Tab.6Rfvalues of superoxide isozymes ofDispacusfrom eight origins

样品编号Rf1Rf2Rf3Rf410．1670．450—0．6002—0．433—0．6333—0．467—0．6334—0．467—0．6335—0．467—0．66760．2670．4330．5330．63370．3000．4330．5000．60080．3000．4330．5000．567

表7 8个不同品种续断酶谱间相似系数(SOD)

Tab.7 Similar coefficient of isoenzyme bands ofDipsacusasperin eight different regions

品种编号1234567811．00020．4001．00030．4001．0001．00040．4001．0001．0001．00050．4001．0001．0001．0001．00060．8560．6670．6670．6670．6671．00070．8560．6670．6670．6670．6671．0001．00080．8560．6670．6670．6670．6671．0001．0001．000

由相似系数可知，2、3、4、5号之间相似系数都为1.000，说明它们的亲缘关系很接近.6、7、8号之间相似系数也为1.000，它们的亲缘关系也很接近.

2.2.3 遗传距离及聚类分析 根据相似系数的聚类结果表明，在聚类距离0.560左右，8份续断材料可以分为四大类.第一类只有鹤峰县五里坪的续断；第二类包括利川市元堡、恩施市双河、建始县龙坪、恩施市鱼塘坝硒矿区的续断；第三类只有鹤峰县太平乡的续断；第四类包括巴东县绿葱坡和恩施市鱼塘坝上坝的续断.

3 结论与讨论

同工酶是由基因决定的，同工酶谱带的差别能够反映不同地区续断间遗传基础的相互联系与差异.恩施州8个产地续断的过氧化物同工酶酶谱条带数目最多4条，最少1条，除了巴东县绿葱坡地区的没有第二条谱带以外，其他7个地区的都有第二条谱带.超氧化物歧化酶谱条带数目最多4条，最少2条，并且都有第二条和第四条谱带，说明各地区五鹤续断有着共同的遗传基础.比较两种酶的聚类分析结果可以看出，利川市元堡和恩施市双河地区的续断亲缘关系很近，鹤峰县太平乡和恩施市鱼塘坝上坝地区的续断亲缘关系很近.巴东县绿葱坡与其他地区的差异较大，可能是由于巴东与其他地区气候差异较大，该产区的续断发生了基因突变.

[1] 廖朝林,林先明,胡斌,等.开展道地药材新品种选育促进恩施州中药材种植业的发展[J].中药研究与信息,2003，

[3] Rusling J F,Nassar A E F.Enhanced electron transfer for myoglobin in surfactant films on electrodes [J].J Am Chem Soc,1993,115(25):11891-11897.

[4] Rusling J F.Enzyme bioelectrochemistry in cast biomembrane-like films [J].Acc Chem Res,1998,31(6):363-369.

[5] Gong K P,Yan Y M,Zhang M N,et al.Electrochemistry and electroanalytical applications of carbon nanotubes:A review[J].Anal Sci,2005,21:1383-1393.

[6] Wang J.Carbon-nanotube based electrochemical biosensors: A review [J]. Electroanalysis,2005,17(1):7-14.

[7] 蔡称心,陈静,包建春,等.碳纳米管在分析化学中的应用[J].分析化学,2004,32(3):381-387.

[8] Gooding J.Nanostructuring electrodes with carbon nanotubes:A review on electrochemistry and applications for sensing[J].Electrochimica Acta,2005,50(15):3049-3060.

[9] 蔡称心,陈静.碳纳米管电极上辣根过氧化物酶的直接电化学[J].化学学报,2004,62(3):335-340.

[10] 夏咏梅.抗菌性表面活性剂[J].日用化学工业,1988(2):17-22.

[11] Cai C,Chen J.Direct electron transfer and bioelectrocatalysis of hemoglobin at a carbon nanotube electrode[J].Anal Biochem,2004,325:285-292.

[12] Liu Y,Jiang Q,Lu S,et al.Immobilization of hemoglobin on the gold colloid modified pretreated glassy carbon electrode for preparing a novel hydrogen peroxide biosensor[J].Appl Biochemi Biotechnol,2009,152(3):418-427.