恩施州川续断的RAPD分析

李 慧,蒲 鑫,武 芸,丁 莉*

(1.湖北民族学院 生物科学与技术学院,湖北 恩施 445000;2.湖北省生物资源保护与利用重点实验室(湖北民族学院),湖北 恩施 445000)

川续断为双子叶植物纲菊亚纲川续断目川续断科植物.因产地湖北五峰县、鹤峰县的品质优良，资源丰富，常被称作“五鹤续断”，是常用的中药之一，具有补肝益肾，续接筋骨，抗骨质疏松，止血安胎等功效.川续断中含有挥发油、生物碱、多糖、蛋白质和多种重金属离子等主要有效成分.关于川续断植物的研究主要集中在道地历史考证、有效成分及药理作用等，分子生物学方面的研究甚少[1-2].另外，在对川续断进行研究时，发现不同产地的植株之间光合能力和同工酶方面存在差异[3-4]，从分子水平探讨其是否存在遗传方面差异尚未见研究.

为了发掘新的川续断种质资源，培育川续断新品种，本试验以恩施州8个不同产地的川续断单株为研究材料，采用RAPD技术进行了聚类分析，从而研究材料间的遗传学差异，旨在为今后进一步开发利用川续断提供参考[5].

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料来源见表1.

表1 供试材料来源

1.2 试剂与仪器

Taq DNA聚合酶购自Promega(上海)；dNTPs(2.5 mmol/L each)；Tris base为武汉天源生物技术有限公司分装的Amresco;RAPD随机引物购自上海生工生物工程有限公司,琼脂糖产于spain的Biowest Agarose；DL3000 DNA Marker购自上海雷浩信息科技有限公司,其他试剂均为国产分析纯生化试剂.

飞鸽牌GL-16G-A高速冷冻离心机，BIORAD凝胶成像系统，BeckmanD/U530紫外分光光度计，新飞BCD-219冰箱V，Biohit proline移液枪，美国ABI2720型PCR扩增仪，DYY-10C型电泳仪(北京市六一仪器厂)，HH-2数显恒温水浴锅.

1.3 基因组DNA提取与浓度检测.

以CTAB法提取上述材料，参照李合生等的方法[5].

取上述方法提取的基因组DNA 30 μL，稀释100倍，在紫外分光光度计上测A230、A260、A280，根据DNA浓度(μg/mL)=50×OD260 nm×稀释倍数，确定DNA母液浓度，进而按50 ng/μL进行稀释.

1.4 PCR扩增与产物检测

反应采用20 μL的PCR体系，其中模板DNA浓度 为50 ng/μL，引物浓度为1.0 μmol/L，Mg2+浓度为2.5 mmol/L的，dNTP各0.2 mmol/L,Taq酶1.0 U，39℃的退火温度在ABI2720型PCR扩增仪中进行反应.反应程序为:94℃预变性5 min;94 ℃变性30 s, 39℃退火40 s, 72℃延伸2 min,43个循环;最后72℃延伸10 min,4℃保存.得到的产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，EB中染色30 min，凝胶成像系统照相保存.

1.5 数据分析

对扩增后电泳带的总数及多态性带数进行统计，按照Nei[6]的公式，根据材料间谱带的数目，求出各自材料间的相似系数：R=2Nxy/(Nx+Ny)；其中R为材料x和y的相似系数，Nxy代表材料x和y经RAPD扩增后所共有的条带数目，Nx和Ny分别代表x和y材料分别具有的总扩增条带数.并根据在某一位点形成谱带记为1，某一位点未形成谱带记为0，构建8个产地续断基于RAPD扩增的谱带原始二态数据矩阵，利用NTSYS(2.01)软件进行聚类分析.

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取结果

采用CTAB法提取的DNA条带较均一，无降解弥散的现象.说明CTAB法适合五鹤续断基因组DNA的提取，这与其他研究结果一致[7].

2.2 RAPD扩增结果

通过对RAPD反应体系各重要因素的优化，从50条随机引物中筛选出了扩增条带丰富、多态性好的5条引物序列，并发现这些序列的G/C含量都在50%以上(见表2).图1、2为引物P7、P9对8份材料的扩增结果.RAPD统计结果表明，5条引物总共扩增出53条电泳谱带，得到的DNA片断大小为300～2 500 bp.其中，引物P7扩增的带中，所有材料在1 000 bp和1 600 bp处有共有带，其余条带均为多态性带.综合各引物的扩增带，得到8份材料川续断的分子识别表(见表3).引物P9扩增出的14条带中，所有材料在DNA片段100、600、800、1600、1 800、2 000、2 300 bp处均有共同的条带，在DNA片段400 bp处，只有建始县龙坪、鹤峰县太平乡和鹤峰县五里坪在这个位点上形成条带(图1、2)，其他产地的续断在这个位点上均未形成带.

表2 筛选出的引物及其序列

图1 P7引物的扩增效果 图2 P9引物的扩增效果 Fig.1 Amplification products of primer P7 Fig.2 Amplification products of primer P9

产地总谱带数可与其他产地区别的位点产地总谱带数可与其他产地区别的位点建始县龙坪乡251900bp利川市元堡乡25—恩施市鱼塘坝上坝25—恩施市鱼塘坝硒矿区23—巴东县绿葱坡24—恩施市双河乡19—鹤峰县太平乡231500bp鹤峰县五里坪23—

2.3 相似系数的分析

由表4可见，8个产地基于RAPD扩增反应得到的条带之间相似系数差异较小，波动的幅度在0.81～0.96，说明材料间亲缘关系较近，变异较小.

表4 续断基因型相似系数对称性矩阵

图3 基于RAPD的续断聚类分析图Fig.3 Dendrogram by cluster analysis of Dipsacus asper by RAPD

2.4 个体水平的聚类分析

由图3可以看出，利用RAPD方法，根据相似系数的聚类结果，在聚类距离0.85左右，可将8份川续断材料分为三大类.第Ⅰ大类包括川续断1号(建始县龙坪)、川续断2号(利川市元堡)、川续断3号(恩施市鱼塘坝上坝)、川续断4号(恩施市鱼塘坝硒矿区)、川续断5号(巴东县绿葱坡)；第Ⅱ包括川续断7号(鹤峰县太平乡)和川续断8号(鹤峰县五里坪)；川续断6号(恩施市双河)独立分为一类.

3 讨论

RAPD分子标记技术因为具有可供选择标记数量多、无器官和发育时期的特异性等优点，已被广泛应用于生物的遗传多样性及亲缘关系研究，特别适用于近缘属级以下(包括近缘属间)的研究[8].

从本研究的RAPD电泳图谱可以看到，8个不同产地的川续断材料的主要谱带基本一致，说明它们的亲缘关系很近，但次谱带间又存在着较细微的差异，说明存在一定的遗传多样性.根据遗传关系聚类分析，地理位置很近的恩施市鱼塘坝上坝、恩施市鱼塘坝硒矿区和恩施市双河的川续断没有分成一类，可能是由于前两者处于硒矿区，而硒在植物生长中有很重要的作用[9-10].除此之外，本实验的分类结果基本以地理分布为主，地理位置越接近的，亲缘关系越近，之间的差异就较小，所以不同的生境是影响川续断不同性状的主要原因之一.另外，在对不同产地的续断的过氧化物同工酶研究中，将8份材料分为了2大类，与本研究的分类结果基本一致，说明这种分析方法是可行的.

利用分子生物学方法研究恩施州内的川续断的种质资源，从分子水平揭示其亲缘关系的远近，不仅可以为川续断的系统选育和引种栽培提供理论依据，还可以为进一步研究川续断种质资源的起源和进化问题提供参考.

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