高效价冻干人用狂犬病疫苗暴露后免疫程序的研究

汝东宇，雷连成

(吉林大学畜牧兽医学院微生物与免疫学实验室，吉林长春130000)

狂犬病是由狂犬病病毒引起的人兽共患疾病。根据世界卫生组织的报告，全世界每年死于狂犬病的患者约55 000例，99%的病例发生在发展中国家，其中亚洲约占全球狂犬病发病总数的56%，非洲约占发病总数的44%。其中印度发病人数最多，位居第一，我国次之［1-2］。人用狂犬病疫苗的免疫分为暴露前免疫及暴露后免疫，各国推荐使用的人用狂犬病疫苗免疫程序也不相同［3-4］。世界卫生组织推荐的狂犬病毒暴露前免疫方案为0、7、21或28 d各免疫1剂量的疫苗，疫苗效力不低于2.5 IU/剂。暴露后免疫则有多种方案：埃森法(Essen regimen)，第0、3、7、14和28天各肌肉注射1个剂量的疫苗(2.5 IU)。萨格勒布法(Zagreb regimen，2-1-1)，第0天，分别在左和右上臂肌肉各注射1个剂量的疫苗，此后于第7和21天，各将1个剂量的疫苗注射至上臂，此种程序可免去2次就诊和1剂疫苗。泰国红十字会皮内注射法(Thai Red Cross Schedule“2-2-2-1-1”法)，第0、3、7天，在2个不同的淋巴引流区(通常为左、右上臂)皮内注射1个剂量(0.1 mL)的疫苗，在第30和90天各注射0.1 mL疫苗。8部位皮内注射法(8-0-4-0-1-1)，第0天，在8个不同部位皮内注射1个剂量疫苗(0.1 mL)。第7天，在每侧上臂和每侧大腿的外侧皮内注射4个0.1 mL的疫苗，此后，第28和90天各注射0.1 mL剂量的疫苗。上述各国应用的人用狂犬病疫苗免疫方案均需接种4针次以上疫苗，全程免疫时间为21～90 d。在萨格勒布方案中，虽只接种4针，但在暴露后第3天没有接种疫苗，而第3天对暴露后伤口的检查是非常重要的。本文制备了一种高效价的冻干人用狂犬病疫苗，在高效价的基础上，以减少狂犬病疫苗的免疫针次并缩短全程接种时间，对暴露后免疫程序进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物BALB/c小鼠，雌性，11～13 g;比格犬，5～6 kg(上海交通大学实验动物中心，经狂犬病毒抗体检测为阴性)。

1.1.2 病毒和细胞狂犬病街毒株CNX8601(由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供，1986年分离自中国宁夏病人脑组织);狂犬病街毒株BD06(由军事医学科学院军事兽医研究所流行病学研究室提供);狂犬病病毒株CVS11;BSR细胞(由武汉生物制品研究所基因工程室提供)。

1.1.3 试剂和标准品人用狂犬病毒免疫球蛋白(21.4 IU/mL)，购自中国药品生物制品检定所;FITC标记的抗狂犬病毒核蛋白荧光抗体(Chemico);胎牛血清、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、谷氨酰胺、DMEM培养基(GIBCO);丙酮(北京化工厂);依文思蓝(Sigma)。

1.1.4 实验样品高效价冻干人用狂犬病疫苗(HPRabV)，效价6.0 IU/剂，冻干人用狂犬病疫苗(RabV)，效价3.1 IU/剂。

1.2 方法

1.2.1 以小鼠为试验动物HPRabV暴露后保护效果评价BALB/c小鼠，11～13 g，随机分成3组，每组32只;狂犬病街毒株CNX8601，毒力为4.2 LgLD50，病毒采用30 LD50剂量接种于小鼠咬肌，接种病毒后2 h，腹腔免疫0.5 mL实验用疫苗。HPRabV(6.0 IU/剂)按0、3、14免疫程序免疫，RabV按0、3、7、14、28免疫程序免疫，设病毒对照组。于第5、7、10、14、18、22、26、33、37、44天于眼眶后静脉采血，分离血清，采用RFFIT法测定血清中的中和抗体效价［5］。对HPRabV和RabV产生的中和抗体进行统计分析。每天观察小鼠死亡情况，于第4天开始记录死亡的小鼠，根据病毒对照组死亡率及疫苗组的生存率计算HPRabV和RabV的保护率，并对两者进行评价。

1.2.2 以比格犬为实验动物HPRabV暴露后保护效果评价实验动物为比格犬，体重5～6 kg，随机分成4组，每组10只，每只均咬肌接种200 000 LD50狂犬病街毒BD06株，前腿肌肉注射HPRabV(效价6.0 IU/剂)或RabV(效价3.1 IU/剂)，并设病毒对照组。免疫程序：①HPRabV于0、3、10 d各接种1剂量的疫苗;②HPRabV于0、3、14 d各接种1剂量的疫苗;③RabV于0、3、7、14、28 d各接种1剂量的疫苗;④病毒对照组。各组分别在5、7、10、14、18、22、26、33、37、44 d用注射器颈部静脉取血1.0 mL，37℃放置1 h，4℃12 h，5 000 r/min离心10 min，吸取上层血清，56℃灭活30 min，利用RFFIT法检测血清中的中和抗体效价。观察并记录实验动物死亡情况，计算疫苗保护率。

2 结果与分析

2.1 小鼠暴露狂犬病街毒后接种HPRabV和RabV产生的中和抗体比较

以小鼠为实验动物的暴露后免疫保护实验中和抗体测定结果显示，HPRabV 0/3/14同RabV 0/3/7/14/28比较，经统计分析，P＜0.05，2组之间相比有显著性差异，HPRabV 0/3/14产生的中和抗体高于RabV 0/3/7/14/28组。

图1 小鼠暴露街毒后接种HPRabV和RabV产生的中和抗体检测结果Fig.1 RVNA responses induced by HPRabV(6.0 IU/dose)and RabV(3.1 IU/dose)in BALB/c post exposure

2.2 小鼠暴露狂犬病街毒后接种HPRabV及RabV的保护率

小鼠咬肌接种狂犬病街毒CNX8601，剂量为30LD50，结果病毒对照组死亡率为93.8%，HPRabV组疫苗保护率为56.2%，RabV组的保护率为40.6%，结果见图2。

图2 小鼠暴露狂犬病街毒后接种HPRabV及RabV的保护率Fig.2 Survival rate of BALB/c mice after post-exposure prophylaxis

2.3 以比格犬为实验动物暴露后免疫中和抗体检测结果

利用RFFIT法检测血清中的中和抗体效价，计算各组中和抗体几何平均效价(IU/mL)，结果见图3。经统计学分析，HPRabV 0/3/10组、HPRabV 0/3/14组与RabV 0/3/7/14/28组之间分别进行中和抗体水平比较，经t检验，P＞0.05，不同免疫程序产生的中和抗体效价均无显著性差异。免疫后10 d前HPRabV组中和抗体水平明显高于RabV组。第10天抗体检测，RabV组为23.8 IU/mL，HPRabV组为29.5 IU/mL和29.0 IU/mL，HPRabV组与RabV组分别进行t检验，P＜0.001，有极显著性差异。同时第5、7天HPRabV组中和抗体水平均高于RabV组。HPRabV能够更早的刺激机体产生高效价的中和抗体。HPRabV 0/3/10组与HPRabV 0/3/14组间比较，两者前期(0～18 d)中和抗体几何平均效价基本持平，而后者在后期(22～56 d)中和抗体几何平均效价均高于前者。

图3 比格犬暴露后2种疫苗不同免疫程序产生的抗体效价比较Fig.3 RVNA responses induced by HPRabV and RabV in beagles post exposure prophy laxis

2.4 比格犬暴露狂犬病街毒后疫苗保护率结果

比格犬经200 000 LD50狂犬病毒街毒株BD06攻击后，2种不同效价疫苗的保护率结果见图4。由图4可见，病毒对照组死亡率为100%，表明比格犬街毒暴露后保护率试验结果成立。街毒攻击后HPRabV 0/3/10免疫程序死亡3只实验动物，疫苗保护率为70%;HPRabV 0/3/14免疫程序死亡2只实验动物，疫苗保护率为80%;RabV 0/3/7/14/28免疫程序死亡3只实验动物，疫苗保护率为70%。保护率试验结果表明HPRabV 0/3/10组、HPRabV 0/3/14组与RabV 0/3/7/14/28组街毒攻击均具有保护作用，HPRabV 0/3/14组疫苗保护率高于其他2组。

图4 街毒攻击后2种疫苗不同免疫程序免疫比格犬保护率结果Fig.4 Survival rate of beagles after post-exposure prophylaxis

3 讨论

狂犬病疫苗主要应用于暴露后免疫，WHO推荐使用的是埃森法，在0、3、7、14、28 d各免疫1个剂量的人用狂犬病疫苗，疫苗的效力不低于2.5 IU/剂，本研究制备的高效价冻干人用狂犬病疫苗(6.0 IU/剂)目标是使暴露后免疫针次减少到3针，达到和现有疫苗同样的保护效果。

以小鼠为实验动物的暴露后免疫保护实验中和抗体测定结果显示，HPRabV 0/3/14同RabV 0/3/7/14/28比较，经统计分析，P＜0.05，2组之间相比有显著性差异，HPRabV 0/3/14产生的中和抗体高于RabV 0/3/7/14/28组。并且2组的最高值均出现在18～22 d，2组产生的中和抗体水平消长情况比较相似，是高效价冻干人用狂犬病疫苗比较理想的免疫程序。

在以比格犬为实验动物的暴露后免疫程序研究中，以BD06株作为攻击用毒株，病毒对照组死亡率为100%，表明本次比格犬街毒暴露后保护率试验结果成立。HPRabV 0/3/10免疫程序疫苗保护率为70%;HPRabV 0/3/14免疫程序疫苗保护率为80%;RabV 0/3/7/14/28免疫程序疫苗保护率为70%。保护率试验结果表明HPRabV 0/3/10组、HPRabV 0/3/14组与RabV 0/3/7/14/28组街毒攻击均具有保护作用，HPRabV 0/3/14组疫苗保护率高于其他2组。

［1］ 俞永新.狂犬病和狂犬病疫苗(第2版)［M］.北京：中国医药科技出版社，2009.

［2］ WHO Weekly Epidemiological Record［M］.2007，49/50：425-435.

［3］ Manning SE，Rupprecht CE，Fishbein D，et al.Human rabies prevention-United States，2008：recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices［J］.MMWR Recomm Rep，2008，57(RR03)：1-26，28.

［4］ LeGuerrier P，Pilon PA，Deshaies D，et al.Pre-exposure rabies prophylaxis for the international traveler：a decision analysis［J］.Vaccine，1996，14(2)：167-176.

［5］ F-X Meslin，MM Kaplan，H Koprowski.Laboratory techniques in rabies.4th Edn［M］.World Health Organization publications，1996.