变异三角酵母D—氨基酸氧化酶基因的克隆与表达

赵沁沁,刘 军

(武汉工业学院生物与制药工程学院,湖北武汉 430023)

D—氨基酸氧化酶 (DAAO)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD)为辅基的黄素酶类[1]。D—氨基酸氧化酶在 D—氨基酸定性定量分析[2]、生物传感器[2]、D,L-氨基酸混合物的酶法拆分 、抗生素关键原料的生产[3]等方面有重要的应用前景。

高效价廉地生产D—氨基酸氧化酶是实现其工业应用的前提。利用野生菌株发酵产酶成本高,难于实现工业化生产。利用工程菌株生产D—氨基酸氧化酶是得到大量、价廉 D—氨基酸氧化酶的有效途径。已经在多种生物中克隆到D—氨基酸氧化酶基因,包括纤细红酵母[4]、变异三角酵母[5]等多种酵母菌。从已报道的文献来看,来源于变异三角酵母 (Trigonopsis variabilis)的 D—氨基酸氧化酶基因构建的工程菌最有希望实现产业化生产。D—氨基酸氧化酶基因虽已在大肠杆菌、酵母菌中进行了表达,但因表达水平低等原因至今未扩大生产[6]。本研究利用跨内含子 PCR技术从变异三角酵母基因组中克隆其 D—氨基酸氧化酶基因,构建表达变异三角酵母D—氨基酸氧化酶基因的大肠杆菌工程菌株,希望得到表达水平高、酶活力强的工程菌株,为利用工程菌生产D—氨基酸氧化酶奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验菌株

变异三角酵母 (Trigonopsis variabilis)、大肠杆菌BL21(DE3),为武汉工业学院微生物与生物技术实验室保存。

1.2 试剂盒和试剂

E.Z.N.A.Yeast DNA Kit购自 Omega公司 ;限制性内切酶,T4 DNA连接酶及 PyrobestT M DNA Polymerase均购自宝生物工程 (大连)有限公司;质粒小量提取试剂盒,PCR产物回收试剂盒,琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自上海捷瑞生物工程有限公司;丙烯酰胺 (Acr)及甲叉双丙烯酰胺 (Bis)购自Fluka公司;四甲基乙二胺 (TEMED)购自 Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.3 PCR引物

参照 Gen Bank中变异三角酵母 D—氨基酸氧化酶基因序列设计引物,上游引物：5’-CATGCCATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGGGCCGGTGTTGCCGGTT TAAC-3’,下游引物：5’-CCCAAGCTTCT AAAGGTTTGGACGAG-3’。上游引物和下游引物分别有NcoⅠ和 HindⅢ酶切位点,用下划线标出。

1.4 酵母基因组 DNA提取

用 YPD培养基培养变异三角酵母,至 OD600值为 10,取 3mL培养物,离心收集菌体,用 E.Z.N.A.YeastDNA Kit提取变异三角酵母基因组 DNA。

1.5 PCR扩增D—氨基酸氧化酶基因

以变异三角酵母基因组 DNA为模板,扩增其D—氨基酸氧化酶基因。PCR反应体系 (25μL)：无菌的三蒸水 19μL,10×buffer 2.5μL,上、下游引物各加 0.5μL,dNTP 1μL,Pyrobest DNA Polymerase 0.5μL,基因组 DNA 1μL。PCR反应条件为：94 ℃5 min;94℃1 min,52℃1 min,72℃1.5 min,30个循环;72℃10min。

1.6 D—氨基酸氧化酶基因表达质粒的构建与鉴定

回收 PCR扩增产物,用 N coI和 HindⅢ双酶切,琼脂糖电泳,切胶回收。将 pET-28a质粒用 N co I和 HindⅢ双酶切,回收酶切后的载体。将目的基因与载体连接,连接产物转化大肠杆菌 BL21(DE3),并涂布在含有卡那霉素的 LB琼脂平板上;挑取在平板上长出的单菌落培养,用 PCR筛选阳性转化子,并测序确证。

1.7 D—氨基酸氧化酶的诱导表达及 S DS-PAGE分析

将重组菌 37℃培养过夜,接种 1mL菌液于装有 50mL含卡那霉素的 LB液体培养基的三角瓶(250mL)中,37℃、250 rpm下培养至 OD600值为1.0,加入终浓度为 1mM的 IPTG,对工程菌进行诱导表达 5 h,以不加 IPTG的同样条件下培养的培养物作为对照。SDS-PAGE电泳分析表达产物。

1.8 DAAO酶活的测定

DAAO酶活检测是根据酶和 D—氨基酸反应生成相应的酮酸,酮酸与 2,4-二硝基苯肼反应,在碱性条件下有可溶性的棕色生成物,在 550nm处可以进行定量检测[7]。

取 1mL发酵液离心收集菌体。用 1mL pH 8.0的 0.1mol/L的磷酸缓冲液将菌体进行重悬,加入 0.1mL100 mmol/L的 D—丙氨酸溶液和 0.1mL的牛肝过氧化氢酶 (400U),37℃水浴反应 15min后,加入0.48mL的对硝基苯肼 (2mg/mL)溶液,终止反应,静置 10min,加入 1.7mL 3mol/L的 NaCl溶液显色,于550nm处测定吸光度。DAAO酶活力单位定义为每分钟氧化脱氨生成 1μmoL酮酸所需要的酶量。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增D—氨基酸氧化酶基因

用Omega公司酵母基因组提取试剂盒提取变异三角酵母 (Trigonopsis variabilis)基因组 DNA,参照 GenBank中 D—氨基酸氧化酶基因序列设计引物,通过 PCR扩增变异三角酵母 D—氨基酸氧化酶基因编码区序列,将 PCR产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳,结果见图1。

图1 PCR扩增 D—氨基酸氧化酶基因 (1-2—PCR扩增产物;M—DL-2000核酸分子量标准)

从图1可知,通过 PCR从变异三角酵母基因组中扩增出一条特异性条带,该条带约 1100 bp,与变异三角酵母D—氨基酸氧化酶基因编码区大小一致。

2.2 D—氨基酸氧化酶表达质粒的构建及鉴定

将回收的 PCR扩增产物,经 NcoI和 HindⅢ双酶切后,琼脂糖电泳,切胶回收酶切片段。将 pET-28a质粒用 NcoI和 HindⅢ双酶切,回收双酶切质粒。用 T4 DNA ligase将目的基因与载体连接,得到重组质粒 pET-28a-DAAO,重组质粒构建过程如图2。将该重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3),涂布在含有卡那霉素的 LB琼脂平板上,挑单克隆培养。用 PCR筛选重组克隆见图3。

图2 pET-28a-DAAO重组载体的构建

图3 PCR鉴定阳性克隆 (1—6—随机挑取的单菌落,M—DL-2000核酸分子标准量)

对 PCR筛选的阳性克隆进行测序,Blast结果表明,所克隆到的序列与 GenBank中变异三角酵母D—氨基酸氧化酶基因编码区序列同源性达 99%以上,表明重组工程菌株BL21(DE3)/pET-28a-DAAO构建成功。

2.3 D—氨基酸氧化酶的诱导表达及酶活测定

按常规方法对工程菌进行诱导,表达变异三角酵母 D—氨基酸氧化酶。结果见图4。

从图4可知,重组菌株表达出分子量为 40 kD的蛋白分子,与预期的DAAO分子量相一致。

图4 SDS-PAGE电泳分析 DAAO在重组菌中的表达2、4—未经 IPTG诱导的菌;1、3—经 ITPTG诱导 5h的菌;1、2—来自一个克隆;3、4—来自另一个克隆;M—中分子量蛋白标准

对诱导 5 h的重组菌培养物进行酶活测定,酶活为 25.2 U/mL,表明所构建的工程菌能较高水平表达 D—氨基酸氧化酶。

3 结论

本研究参照 Gen Bank中D—氨基酸氧化酶基因序列设计引物,利用跨内含子 PCR技术直接从变异三角酵母 (Trigonopsis variabilis)基因组中扩增变异三角酵母 D—氨基酸氧化酶基因编码区序列,成功构建了产变异三角酵母D—氨基酸氧化酶的重组工程菌 BL21(DE3)/pET-28a-DAAO。与先提取三角酵母总 RNA,反转录后进行 PCR扩增得到 DAAO基因相比,此方法更加简便[8]。本研究所构建大肠杆菌工程菌株表达水平高,为利用工程菌生产 D—氨基酸氧化酶提供了基础。

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[8] 罗晖,童忆舟,李强,等.三角酵母 D—氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达[J].微生物学报,2004,44(3)：336-339.