动物专用喹诺酮类药物对嗜水气单胞菌体外抑菌作用的研究

苏振霞, 肖 辉, 陈列欢, 张永立

(1. 淮海工学院 海洋学院, 江苏 连云港 222005; 2. 江苏省海洋资源开发研究院 甲壳素研发中心, 江苏连云港 222005)

动物专用喹诺酮类药物对嗜水气单胞菌体外抑菌作用的研究

苏振霞1,2, 肖 辉1,2, 陈列欢1,2, 张永立1

(1. 淮海工学院 海洋学院, 江苏 连云港 222005; 2. 江苏省海洋资源开发研究院 甲壳素研发中心, 江苏连云港 222005)

采用琼脂平板扩散法研究了乳酸恩诺杀星、盐酸恩诺沙星、氧氟沙星、盐酸沙拉沙星等11种抗生素对嗜水气单胞菌的体外抑菌作用, 测定了抑菌圈大小; 采用双倍试管稀释法测得了最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。实验结果表明, 盐酸左氧氟沙星、氧氟沙星、盐酸沙拉沙星对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的抑菌效果最好, 其MIC分别为0.012, 0.024, 0.024 mg/L。乳酸恩诺沙星,盐酸恩诺沙星, 氧氟沙星对嗜水气单胞菌的杀菌活性最强, 其MBC为1.563 µg/mL。

氟喹诺酮; 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila); 最小抑菌浓度; 最小杀菌浓度

嗜水单胞菌(Aeromonas hydrophila)广泛分布于池水、淤泥等自然环境[1-2]。目前, 在生产中发现由嗜水气单胞菌感染的爆发性出血病较多, 如白鲢暴发性出血病、甲鱼败血病、黄鳝出血病、鳗鲡红鳍病等。由嗜水气单胞菌感染的疾病一般病势较猛, 多为恶性传染病, 死亡率很高。

目前我国水产养殖中抗菌药物的长期使用或滥用所引起的病原菌耐药性问题严重, 对水产养殖业造成了巨大的经济损失。喹诺酮类药物作为一种广谱高效的抗菌药物, 目前已广泛应用于水生动物的疾病治疗[3-4]。使用该类药物治疗水生动物的细菌性疾病时, 大多是借鉴兽医对哺乳动物的研究成果, 因此造成该类药物在水产业疾病防治用药的盲目性[5]。

在治疗鱼病实践中, 喹诺酮类药物的用量呈逐年增长的趋势。为了能正确选择和安全使用该类药物, 本实验测定了11种动物专用喹诺酮类药物对嗜水气单胞菌的体外抑菌作用, 从中筛选出对嗜水气单胞菌有较好体外抑制作用的喹诺酮类药物, 旨在为该菌引起的爆发性鱼病的防治提供科学的用药依据。

1 实验材料

1.1 菌种

实验用嗜水气单胞菌由淮海工学院海洋学院生物技术实验室提供。

1.2 药品

盐酸恩诺沙星(纯度99 %, 浙江朗博药业有限公司); 盐酸诺氟沙星(纯度 98%, 浙江省台州市东港兽药有限公司); 乳酸恩诺沙星(纯度 98%, 浙江朗博药业有限公司); 乳酸诺氟沙星(纯度 98%, 浙江省台州市东港兽药有限公司); 盐酸二氟沙星(纯度 99%, 潍坊永兴兽药厂); 盐酸左氧氟沙星(纯度 90.5%, 浙江普洛康裕制药有限公司); 盐酸洛美沙星(纯度 99%,浙江国邦药业有限公司); 氧氟沙星(纯度 98.5%, 浙江普洛康裕制药有限公司); 盐酸沙拉沙星(纯度98%, 潍坊永兴兽药厂); 甲磺酸培氟沙星(纯度77%,宜昌天仁药业有限责任公司); 烟酸诺氟沙星(纯度98%, 浙江省台州市东港兽药有限公司)。

2 实验方法

2.1 药液制备

将以上药品分别配制成 200 mg/L的药物原液,放于冰箱中4℃保存备用。

2.2 菌悬液制备

液体培养基接种嗜水气单胞菌后震荡培养 12～16 h。菌液培养好后用液体培养基稀释到合适浓度。本实验中菌液浓度为1.0×108cfu/mL。

2.3 抑菌圈的测定

固体培养基平板直径90 mm, 平板上加100 µL菌液, 涂抹均匀。用打孔器在每个平板上打 3个孔,做好药物标记。孔中加入药液。放入28 ℃培养箱中培养24 h。观察并用游标卡尺测量抑菌圈。

2.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定

最小抑菌浓度(MIC)的测定采用戴自英双倍试管稀释法[6]。将每种药物作为一组, 每组取 16支编号的无菌试管(其中两支作为对照), 向前 14支试管中各加入液体培养基2 mL, 再用移液枪向1号试管中加200 mg/L的药液2 mL, 并充分混匀; 更换枪头,从1号管中取出2 mL放入2号管; 以此类推, 然后从14号管中吸出2 mL丢弃, 再向前14号管中各加菌液20 µL。最后向对照管1中加2 mL液体培养基,向对照管2中加2 mL液体培养基和20 µL的菌液。置入28 ℃培养箱中培养24 h, 取出后观察, 和对照管相比, 凡是药物最高稀释管中无细菌生长者, 该管的浓度即为该种药物对该菌的最小抑菌浓度(Minimum Inhibition Concentration, 简称 MIC)。

2.5 最小杀菌浓度(MBC)的测定

在MIC实验基础上从无细菌生长的各管取材分别涂布于相应的无菌琼脂平板培养基, 于28 ℃的恒温培养箱培养24～48 h, 观察结果。琼脂平板上无细菌生长且含药液最少一管的药液浓度, 即为该种药物对该菌的最低杀菌浓度(Minimum Bacteriacidal Concentration, 简称 MBC)。

3 结果

3.1 抑菌圈结果分析

11种抗生素对嗜水气单胞菌的抑菌效果见表1。

由表1可知, 这11种抗生素对嗜水气单胞菌的抑菌效果由高到低的顺序为盐酸沙拉沙星、盐酸左氧氟沙星、盐酸二氟沙星、甲磺酸培氟沙星、氧氟沙星、盐酸洛美沙星、盐酸恩诺沙星、烟酸诺氟沙星、乳酸诺氟沙星、盐酸诺氟沙星、乳酸恩诺沙星。

3.2 最小抑菌浓度MIC结果分析

最小抑菌浓度MIC结果分析见表2。

由表 2可知, 盐酸左氧氟沙星对嗜水气单胞菌的抑菌效果最好, 最小抑菌浓度为 0.012 µg/mL, 氧氟沙星、盐酸沙拉沙星、盐酸二氟沙星抑菌效果次之, 分别为0.024 , 0.024 , 0.049 mg/L。

表1 11种抗生素对嗜水气单胞菌的体外抑菌圈直径影响 Tab. 1 Inhibitory circles of eleven fluoroquinolones(FQs)against Aeromonas hydrophila

表2 11种抗生素对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度影响Tab. 2 MICs of eleven fluoroquinolones (FQs) against Aeromonas hydrophila

3.3 最小杀菌浓度MBC结果分析

由表3可知, 11种抗生素中对嗜水气单胞菌的杀菌效果最好的为乳酸恩诺沙星, 盐酸恩诺沙星, 氧氟沙星, 其MBC均为1.563 mg/L。而乳酸诺氟沙星、烟酸诺氟沙星和盐酸诺氟沙星对嗜水气单胞菌的杀菌效果最差, 烟酸诺氟沙星的MBC为50 mg/L, 乳酸诺氟沙星和盐酸诺氟沙星的MBC大于100 mg/L。

4 讨论

喹诺酮类药物作为一种广谱高效的抗菌药物,应用于水产养殖细菌病的防治始于20世纪70年代,随着药物价格的下降, 目前已被广泛应用于水生动物的疾病治疗[5]。目前, 应用于水产养殖上的喹诺酮类药物主要有诺氟沙星, 氧氟沙星, 恩诺沙星, 沙拉沙星等[7]。

表3 11种抗生素对嗜水气单胞菌的最小杀菌浓度影响Tab. 3 MBCs of eleven fluoroquinolones (FQs) against Aeromonas hydrophila

本实验选用的11种动物专用氟喹诺酮类药物对嗜水气单胞菌均有很强的抗菌作用, 其中以盐酸左氧氟沙星、氧氟沙星、盐酸沙拉沙星对嗜水气单胞菌的抑菌活性最强, 乳酸恩诺沙星, 盐酸恩诺沙星,氧氟沙星对嗜水气单胞菌的杀菌活性最强。

关于喹诺酮类药物对嗜水气单胞菌的抑菌作用的研究报道不太多, 樊海平等[8]2005年报道, 盐酸恩诺沙星对嗜水气单胞菌的MIC和MBC为0.0488 mg/L; 杨雨辉[4]2003年报道, 盐酸恩诺沙星对嗜水气单胞菌的MIC和MBC分别为0.0125 mg/L和0.05 mg/L; 本实验测定的盐酸恩诺沙星和乳酸恩诺沙星对嗜水气单胞菌的MIC为0.098 mg/L, MBC为1.563 mg/L。卢彤岩[9]2004年报道, 菌液浓度影响药物的MIC值, 且菌浓度变化引起MIC和MBC值大小的变化因药物不同而异。在其实验中, 嗜水气单胞菌的接种量在102～105cfu/mL之间变化时, 恩诺沙星的MIC值不变, MBC值变化很小。当细菌接种量增至106cfu/mL, MIC值增加2倍, MBC值增加4倍。本实验测得的盐酸恩诺沙星和乳酸恩诺沙星对嗜水气单胞菌的 MBC较大的原因可能与菌液接种量有关,本实验的嗜水气单胞菌的接种量为106cfu/mL。当然细菌接种量对 MIC的影响并不是一定的。Aagaard等[10]进行了环丙沙星对临床分离的 176株菌的体外抑菌活性试验, 结果表明, 细菌接种量对 MIC无影响。影响药物抗菌作用测定的因素很多, 培养基的选择也会影响到药敏试验的结果[11]。

药物敏感性测定作为筛选药物的主要依据, 仍将是氟喹诺酮类药物研究的重点。但能影响药物对细菌抑制作用的因素很多, 因此, 要科学、准确地测定药物的抗菌作用, 必须最大程度的减少乃至排除各种主客观因素的影响。为了使氟喹诺酮类药物在水产动物疾病防治中得到合理应用, 作为药物敏感性试验的有效补充, 还有待进一步研究其在水产动物的药代动力学及残留, 这对于有效控制水产动物常见细菌性疾病的发生和流行将有重要意义。

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Bacteriostatic action of 11 fluoroquinolones to bacteriumAeromonas hydrophila

SU Zhen-xia1,2, XIAO Hui1,2, CHEN Lie-huan1,2, ZHANG Yong-li1
(1. Huaihai Institute of Technology, School of Marine Science, Lianyungang 222005, China; 2. Jiangsu Marine Resources Development Research Insititute, Chitins Research and Development Center, Lianyungang 222005,China)

Jul., 6, 2010

Fluoroquinolone(FQs);Aeromonas hydrophila; minimum inhibitory concentration; minimum bacteriacidal concentration

In this experiment, agar diffusion method was used to study antibacterial effect of 11 fluoroquinolones(FQs)onAeromonas hydrophila. The inhibition zone was measured, and the double tube dilution method was used to study minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC). The results showed that Levofloxacin hydrochloride, Ofloxacin, and Sarafloxacin hydrochloride had better antibacterial effect onA. hydrophila, and the MIC of the three medicines were 0.012, 0.024, 0.024mg/L, respectively. The Enrofloxacin lactate, Enrofloxacin hydrochloride, and Ofloxacin had the same MBC value of 1.563 mg/L.

S948

A

1000-3096(2011)07-0037-03

2010-07-06;

2010-09-20

淮海工学院自然科学基金项目(Z2009047); 江苏省海洋资源开发研究院开放基金项目(JSIMR10C04)

苏振霞(1978-), 女, 山东临沂人, 副教授, 博士, 研究方向为水产药物药效学及药物动力学, 电话： 0518-85588902, E-mail：suzhenxia@sina.com

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