出芽短梗霉胞外酸性漆酶

王慧娟，孔维甲，靳建忠，张宁，李炳学*

(1.沈阳农业大学土地与环境学院，辽宁沈阳110866;2.沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳110866)

漆酶(氧化还原酶类EC 1.10.3.2，laccase)是一种含铜的多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)，和植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白同属铜蓝氧化酶(blue copperoxidases)家族［1］。在自然界中，漆酶分布于多种植物、真菌体内、以及少数昆虫和细菌中［2］。分泌漆酶的真菌主要存在于半知菌纲(Deuteromycetes)、子囊菌纲(Ascomycetes)和担子菌纲(Basidiomycetes)等高等真菌［3］。其中，担子菌亚门的白腐真菌是主要的木质素降解酶的分泌者［4］，因而也成为漆酶研究的首选菌种资源。木质素氧化酶中锰依赖过氧化物酶(Manganese oxidizing peroxidase，MnP)需要H2O2和Mn2+的存在。另一类过氧化物酶不需要Mn2+，但是H2O2是必要的，被称为不依赖锰过氧化物酶(Manganese independent peroxidase，MiP)。因为H2O2对于MnP和MiP的酶活性是必需的，漆酶(Laccase，Lac)反应不需要H2O2，所以添加过氧化氢酶可以去除反应体系中H2O2污染，测定粗酶液中漆酶的活性。漆酶反应只需要分子氧和底物，而且漆酶的底物非常广泛，因此漆酶的应用潜力大于其他类型的木质素降解酶。由于漆酶可以分解木质素、将色素脱色、氧化苯酚及其衍生物、降解有机氯农药DDT(二氯二苯三氯乙烷)等土壤污染物，所以漆酶是环保领域的常用酶制剂，主要应用在造纸厂的污水处理和纸浆生物漂白［5］、染料脱色［6］、有毒化合物的生物降解和土壤修复以及有机合成［7］等方面。羊毛染色常用的染料在酸性环境下才能着色［8］，此类染料废液酸性很强。处理这类特殊工业染料，就需要酸性漆酶。普通漆酶最适pH接近中性，在酸性环境(pH低于3.0)活性弱而且稳定性低，无法使用。通过酶的化学修饰和基因突变等手段，很难将已有中性漆酶变成耐酸性漆酶，所以寻找新的酸性漆酶资源具有重要现实意义。出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)属于半知菌短梗霉属，是一类具有酵母型和菌丝型等多种形态并且能够合成黑色素的真菌，目前国内外均没有关于其是否合成和分泌多酚氧化酶的报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种A.pullulans NG和A.pullulans CA是本实验保存菌株;CBS 147.97、CBS 584.75、CBS 100225、CBS 110373、CBS 101160、CBS 249.65、CBS 701.76和CBS 110374来自于荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)。

1.1.2 培养基菌株保藏培养基(YAD):葡萄糖2%，(NH4)2SO40.5%，MgSO4·7H2O 0.05%，Yeast extract 0.02%，KH2PO40.1%，琼脂2%，pH 6.0;基础产酶培养基(YND):葡萄糖2%，NaNO30.64%，MgSO4·7H2O 0.05%，Yeast extract 0.02%，KH2PO40.1%，pH 6.0。

1.1.3 主要试剂过氧化氢酶(Sigma)、乙二胺四乙酸(EDTA)、过氧化氢(H2O2:30%)和愈创木酚(2-甲氧基苯酚)等试剂均为分析纯。

1.1.4 仪器SP-722E型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)，SHA-C水浴恒温振荡器(国华)，PHS-25型数字pH计(上海理达仪器厂)，SCR20BC型低温高速离心机(日立)。

1.2 方法

1.2.1 培养条件按体积比1∶100的接种量接种经180 r/min水浴摇床28℃活化18 h的种子液(OD560=3.0)到含有50 mL YND培养基的250 mL三角瓶中，28℃180 r/min震荡培养。将培养一定时间的培养液于4℃，6 000 r/min离心10 min，弃去沉淀得到的上清液即为粗酶液。

1.2.2 多酚氧化酶活性分析①测定酶反应最适pH:在含有2.5 mmol/L愈创木酚的不同pH梯度的缓冲液(pH 1.0～2.0，氯化钾-盐酸缓冲液;pH 2.4～4.0，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)中，加入500 μL粗酶液，总体积为4 mL。30℃反应5 min后用紫外可见分光光度计测定470 nm吸光值(A470)，每处理3重复取平均值。绘制酶反应最适pH曲线，确定各菌株胞外多酚氧化酶最适pH值;②多酚氧化酶活性测定:在pH 2.0氯化钾-盐酸缓冲液中，按照①方法测定出芽短梗霉胞外多酚氧化酶活性。每分钟产生1 nmol显色产物所需的酶量定义为一个酶活单位。酶活性计算:A470=ϵbC(ϵ470=1.21×104L/(mol·cm);b:1 cm;C:mol/L)，酶活U=1.6×106·C=132.23×A470。

1.2.3 确定多酚氧化酶种类［9］在上述多酚氧化酶活性分析体系中，通过添加H2O2(0.05 mmol/L)和Mn2+(20 mmol/L)检测总的木质素氧化酶活性(处理A)。含有H2O2，不添加Mn2+，并且添加EDTA(20 mmol/L)除去反应体系中可能存在的Mn2+，抑制锰过氧化物酶(MnP)，测定的酶活包括MiP和Lac(处理B)。不添加Mn2+，不添加H2O2，并且添加过氧化氢酶(200 U/L)除去反应体系中可能存在的H2O2，抑制MnP和MiP，测定的就是Lac活性(处理C)。在处理C中再添加EDTA(20 mmol/L)为处理D，检测EDTA对Lac活性的影响。活性测定方法同1.2.2，缓冲液pH 2.0，30℃反应5 min测定A470，每处理3重复。

1.2.4 菌株系统发育树以NCBI的GenBank上检索的各菌株的ITS1 rDNA序列，运用MEGA3［10］软件构建各菌株neighbor-joining系统发育树。

2 结果与分析

2.1 出芽短梗霉胞外多酚氧化酶活性分析

通过愈创木酚平板筛选，在候选的10株菌中发现5株菌株分泌胞外多酚氧化酶。该5株菌的摇瓶发酵液胞外多酚氧化酶活性差异很大。NG粗酶液酶活最高，达到110 U/mL。酶活相对较高的是菌株CBS 147.97(48 U/mL)和CA(40 U/mL)，产酶能力较弱的是CBS 584.75(18 U/mL)和CBS 101160(11 U/mL)(图1A)。生长繁殖过程中，不同菌株分泌多酚氧化酶的最佳培养时间也显著不同。产酶最多的NG最佳培养时间为8 d左右，而CBS 584.74仅需3 d即可获得胞外最大酶活。

2.2 胞外多酚氧化酶最适pH分析

对分泌多酚氧化酶的5株菌粗酶进行最适pH测定，NG等4菌株的最适pH为2.0，CBS 584.75最适pH在2.0左右，范围很宽(1.6～2.4)(图1B)。由于出芽短梗霉生长后期胞外环境pH多为酸性，推测该类酸性多酚氧化酶对菌体细胞可能具有特定的生理功能或生态学意义。

图15 菌株胞外粗酶活性分析Fig.1 Enzyme activity of 5 strains crude enzyme

2.3 菌株系统发育树与胞外多酚氧化酶关系

分泌多酚氧化酶的5株菌分布在3个群中，其中NG、CBS 101160和CBS 584.75同属一个群(图2)。该群的其他3菌株，CBS 110373、CBS 110374和CBS 701.76无多酚氧化酶分泌。推测，在进化过程中基因突变导致同一群的不同菌株之间胞外多酚氧化酶的性状变异较大。

2.4 NG菌株多酚氧化酶种类分析

5株分泌多酚氧化酶的出芽短梗霉中NG粗酶液酶活最高，并且在pH 1.2～2.4之间均保持良好的活性(图1B)。为确定NG胞外粗酶性质，进行了多酚氧化酶种类验证试验。处理A为MnP、MiP和Lac均可以反应的阳性对照，酶活为(87.6±1.8)U/mL。处理B测定的酶活包括MiP和Lac，该处理的酶活为(74.0±2.2)U/mL，比处理A总酶活有所降低，但差异不显著。处理C添加过氧化氢酶除去反应体系中可能存在的H2O2，同时抑制MnP和MiP，体现的是Lac活性((71.7±0.7)U/mL)，推测出芽短梗霉中NG分泌的多酚氧化酶就是漆酶。处理D酶活性是处理C的98.5%，表明该类漆酶不被高浓度EDTA(20 mmol/L)显著抑制(表1)。由于二价铜离子能够被EDTA螯合，因此推测出芽短梗霉NG分泌的漆酶不需要铜离子作为辅基。不依赖金属离子作为辅基的漆酶，不需要额外添加辅基稳定活性，在实际应用时更方便，成本也更低。

表1 NG酸性多酚氧化酶属于漆酶的证明Table 1 analysis of the NG acid polyphenol oxidase

3 讨论

本研究发现:出芽短梗霉是分离多酚氧化酶的优良真菌资源，本研究发现供试10株菌中有5株菌具有胞外多酚氧化酶活性;分泌多酚氧化酶的5株菌分布在3个群中，其中NG、CBS 101160和CBS 584.75属同一个群;多酚氧化酶最适pH 2.0左右;菌株NG产生的多酚氧化酶活性最强，经验证是漆酶，该酶不被EDTA抑制。

多数偏酸性漆酶以愈创木酚为底物反应的最适pH多为4.0以上［3］，因此，A.pullulans NG分泌的漆酶是目前发现的最适pH较低的漆酶之一，在酸性漆酶资源开发领域具有巨大潜力。该酸性漆酶的分离纯化和酶学性质分析的工作正在进行中。克隆A.pullulans NG漆酶合成和表达调控的基因，将从基因水平分析该漆酶的合成和分泌规律，是今后研究的重点之一。

图2 基于ITS1 rDNA序列构建MEGA3 neighbor-joining系统发育树Fig.2 Neighbor-joining tree constructed with the MEGA3 package on the basis of ITS1 sequences

致谢:CBS 147.97等8株A.pullulans受赠于荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)G.S.De Hoog教授，特此衷心感谢。

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