肿瘤乏氧显像剂18F-FAZA的自动化合成

刘振锋,赵 葵,董孟杰,王国林,杨树业

浙江大学医学院附属第一医院PET中心,浙江杭州 310003

肿瘤乏氧显像剂18F-FAZA的自动化合成

刘振锋,赵 葵,董孟杰＊,王国林,杨树业

浙江大学医学院附属第一医院PET中心,浙江杭州 310003

为了制备1-α-D-[5’-脱氧-5’-氟阿拉伯呋喃糖基]-2-硝基咪唑(18FAZA),采用两锅法与氟多功能模块,以4～6 mg前体在115℃氟化反应10 min,用C-18柱捕获中间产物,用NaOH水解,HCl中和,进行HPLC分离,得到18FAZA注射液体。总合成时间45 min,放化产率和放射化学纯度分别大于10%与98%。采用两锅法自动合成18F-FAZA,能够满足科研与临床研究的需要。

乏氧;18F-FAZA;PET显像

多数恶性肿瘤组织实质生长迅速,间质生长相对缓慢,导致肿瘤局部血供与需求失衡,发生缺氧;另外,恶性肿瘤代谢旺盛,消耗大量的氧,导致供血不足,使肿瘤局部处于乏氧状态。分子生物学研究发现,乏氧不仅使肿瘤产生针对放、化疗的保护蛋白,增加对放、化疗的抵抗性,而且使肿瘤内氧调节蛋白(ORP)、血管内皮生长因子(VEGF)等表达增加,从而使肿瘤自身的侵袭性也增加。肿瘤组织的乏氧程度决定了肿瘤对放疗或化疗的敏感程度,采用乏氧显像剂,进行 PET显像,可以了解肿瘤的乏氧程度,并勾画生物靶区,制订最有效的放化疗方案。1-α-D-[5’-脱氧-5’-氟阿拉伯呋喃糖基]-2-硝基咪唑(18FAZA)显像剂[1-2]与18F-FMISO[3]相比,具有更快的血液与非靶组织清除率,18F-FMISO主要通过肝脏代谢,而18FAZA则主要经肾脏排泄,肠道内无放射性,腹部肿瘤18F-FAZA图像应优于18F-MISO[4]。

Kumar等[5]对微波辅助下18FAZA的放射性制备做了初步研究,对放射标记中的反应时间、反应条件进行了探索,发现应用微波技术标记比常规放射性标记的标记率要高。Reischl等[6]对18FAZA应用一锅法进行了18FAZA的自动化合成,标记温度为100℃,标记时间为5 min,产率为20%。18FAZA在国外已经被合成并应用到多种肿瘤的调强放疗中,国内尚未见到这方面的报道。应用一锅法合成18FAZA,由于反应成分复杂,会影响合成的重复性与产品的纯度。本研究应用氟多功能模块,采用两锅法,先用C-18柱对氟标记的中间体进行提纯,再对其进行碱水解,自动化合成18FAZA,以改善合成的重复性与产品纯度。

1 实验材料

1.1 试剂和仪器

H218O,丰度95%,美国 Isotec公司;4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10二氮双环[8,8,8]二十六烷(K222),分析纯,德国 ABX公司;NaOH、HCl,分析纯,乙醇为 HPLC级,北京化工厂;二甲基亚砜(DMSO)、绝对无水乙腈,比利时Acros公司;硅胶板 ,英国 Whatman 公司;1-α-D-[5’-O-对甲苯磺酰基-2’、3’乙酰阿拉伯呋喃糖基]-2-硝基咪唑 ,德国 ABX公司;1-α-D-[5’-脱氧-5’-氟阿拉伯呋喃糖基]-2-硝基咪唑,德国ABX公司;Sep-Pak QMA柱,C18 Sep-Pak柱,美国Waters公司。

RDS111加速器,美国CTI公司;双反应管18F多功能化学合成单元(chemistry process control unit,CPCU),北京派特生物有限公司;活度计,美国Bioscan公司;Aligent 1200高效液相色谱、G1311A四元泵、G1316A柱温箱、G1314BVWD检测器、G1328B手动进样器、Flow-Count放射性检测器(BioScan),分析柱为 Agilent eclipse SB-C18(5μm,4.6 mm×150 mm),美国Aligent公司。

1.2 实验动物

KM小鼠,雌雄各半,体重18～22 g,浙江省医学科学院动物中心提供。

2 实验方法

2.1 合成路线

18FAZA的合成路线示于图1。

图1 18FAZA的放射化学合成路线Fig.1 Radiosynthesis of18FAZA

2.2 18F-F-的生产

采用RDS111医用回旋加速器通过18O(p,n)18F核反应,用11 MeV、35μA的质子束流连续轰击靶15 min,用气动方式将18F-F-传输到氟多功能合成模块(图2)中,18F-F-被吸附到Sep-Pak light QMA柱上,等待被淋入反应管中。

2.3 18FAZA的自动化合成

用氟多功能合成模块进行18FAZA的放射化学合成,具体标记操作如下:

(1)加速器生产的18F被QMA柱捕获;

(2)用1号瓶中的1 mL溶液(12.5 mg K222加2.5 mg K2CO3溶于0.1 mL水和0.9 mL乙腈的混合溶液)将18F淋洗到反应管中;

(3)将反应管中的溶液于116℃氮气吹干;

(4)反应管中加入2号瓶中2 mL干燥乙腈,于116℃氮气吹干;

(5)反应管中加入3号瓶中5 mg FAZA前体和0.8 mL干燥DMSO,于115℃反应10 min;

(6)反应管中分3次加入5号瓶30 mL水,将混合液体通过V1与V2阀门之间的C-18柱,标记中间体被捕获在C-18柱上;

(7)反应管中加入2 mL乙醇溶液,将C-18柱上的标记物从反应管1转移到反应管2中;

(8)将反应管2中溶液于120℃氮气吹干;

(9)加入6号瓶中1 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液水解2 min;

(10)加入7号瓶中1 mL 0.5 mol/L的 HCl溶液中和;

图2 18FAZA的自动合成装置示意图Fig.2 Scheme of disposable cassette of18FAZA

(11)将粗产物转移到中转瓶中,启动 HPLC纯化,Alltima C18柱(250 mm×10.0 mm,10μm);流动相为V(乙醇) ∶V(水)=8∶92;流速4 mL/min。

2.4 产品的质量控制

用精密p H试纸测定注射液的p H值,目测其颜色和澄清度;取即时制备的18FAZA注射液,用活度计测定不同时间点的活度值,用半对数作图法估测半衰期和核纯度;用 HPLC系统与标准品对照鉴定产品,并用其与 TLC测定注射液的放射化学纯度。HPLC分析条件:C-18分析柱,流动相为10%的乙醇溶液,流速为1 mL/min,紫外(UV)检测波长为320 nm;在室温下,测定注射液在8 h内不同时间的放化纯度,观测其稳定性;TLC的条件为V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)=9∶1。

2.5 产物的体外稳定性评价

将所制备的18FAZA稀释到37 GBq/L,取0.2 mL,加入到1 mL的小牛血清中,在37℃温育,每隔2 h应用 TLC测量产物的放射化学纯度,观察8 h后稳定性,TLC的展开剂为V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)=9∶1。

2.6 18FAZA的异常毒性实验

KM小鼠(体重18～22 g,给药前未禁食禁水)5只,尾静脉注射18FAZA的注射液3.7×106Bq(0.5 mL),观察48 h后处死并解剖。

3 结果和讨论

3.1 18FAZA的合成

通过国产多功能模块进行乏氧显像剂18FFAZA药物的自动化合成,总合成时间小于45 min,由于前体比较昂贵,选用少量的前体4～6 mg,不校正产率可大于10%(n=10),应用制备型的 HPLC分离18FAZA,18FAZA的 HPLC的保留时间为12 min,随着前体用量的增加,产率也增加(表1),当前体量为15 mg时,不校正产率可以达到25%;用干燥的乙腈做溶剂,在密闭条件下120℃反应10 min,产率只有1%,可能是溶剂内部温度不如DMSO高的原因,用 HPLC级的DMSO进行反应,没有产物,原因是反应必须在无水条件下进行,水参与竞争反应,因而得不到产物。与 Reischl等[6]采用一锅法合成比较,本合成中采用两锅法合成18FAZA,可以先将亲核标记生成的中间体,初步捕获到C-18柱上,除去 K222、DMSO、K2CO3等杂质,消除这些杂质对下一步中间体进行碱性水解的干扰,有效地提高了反应的重复性,同时也使得最终产品经 HPLC提纯更方便,纯化后化学纯度与放射化学纯度更高。如果不用 HPLC分离提纯,而采用固相萃取技术对产物进行快速的分离提纯,合成时间将会大大缩短,合成产率将得到进一步的提高,我们正在进行这方面的探索。

表1 前体用量对不校正放化合成产率的影响Table 1 Radiochemical yield dependence on the amount of precursor without correct

3.2 18FAZA的质量控制与稳定性

18FAZA注射液为无色溶液,p H≈7.0,放射性浓度大于74 GBq/L,比活度不小于7.4×1010kBq/mol。用时间衰变法测定18F半衰期约为110 min,放射性核纯度大于99%。HPLC鉴定测量结果示于图3。由图3看出,参比FAZA标准品的紫外吸收峰(320 nm)与18FAZA放射性峰(tR=7.6 min)一致,为同一物质(由于物质先经过紫外检测器,后经放射性检测器,两者之间管线体积为0.3 mL,所以放射性tR比紫外tR时间滞留0.3 s)。18FAZA的 HPLC与放射性 TLC谱图(图4)显示放射化学纯度大于98%,TLC图谱中18FAZA的Rf=0.75,未标记的18F的Rf=0。18FAZA在小牛血清中8 h后,放射化学纯度仍然大于96%,稳定性良好。

图3 FAZA的HPLC谱图Fig.3 HPLC of FAZA

3.3 异常毒性检查

尾静脉给予18FAZA注射液后,观察48 h,小鼠生长正常,无死亡及不良反应现象发生,解剖后观察,未见任何器官损伤。

图4 18FAZA的TLC谱图Fig.4 TLC chromatogram of18FAZA

4 结 论

应用两锅法,通过氟多功能模块进行乏氧显像剂18F-FAZA药物的自动化合成,总合成时间小于45 min,放化产率和放射化学纯度分别大于10%与98%,药物的体外稳定性良好,急毒性实验显示药品安全,利用该法自动合成的18FAZA注射液能满足科研和临床PET显像的需要。

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Automated Synthesis of18F-Labelled FAZA as Hypoxia Imaging Agent

LIU Zhen-feng,ZHAO Kui,DON G Meng-jie＊,WANG Guo-lin,YANG Shu-ye
PET Center,the First Affiliated Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310003,China

1-(5-[18F]fluoro-5-deoxy-α-D-arabinofuranosyl)-2-nitroimidazole was synthesized by“two pot”method at a multifunctional CPCU made in China and by using 1-(2,3-di-O-acetyl-5-O-tosyl-α-D-arabinofuranosyl)-2-nitroimidazole as precursor.The precursor(4-6 mg)was fluorinated at 115℃for 10 min.The F-18 labeled intermediate was traped by a C-18 column,then was hydrolyzed using NaOH.The reaction mixture was neutralized by adding HCl,and was purified through HPLC.The pure18FAZA is obtained for no more than 45 min.The overall radiochemical yield is more than 10%,and the radiopurity is higher than 98%.18FAZA is successfully autosynthesized through“two pot”method.It can be used in clinical and scientific research.

hypoxia;18F-FAZA;positron emission tomography

R817.4

A

0253-9950(2011)03-0184-04

2010-09-02;

2010-12-16

国家自然科学基金资助项目(30870730);浙江省医药卫生基金资助项目(2007A063);浙江省科技厅基金资助项目(2009C33109)

刘振锋(1980—),男,山东德州人,硕士,主管药师,主要从事正电子药物研发

＊通信联系人:董孟杰(1972—),男,山西万荣人,博士,主治医师,从事正电子药物研发与临床研究