载缓释阿米卡星导尿管的研制及体外释放试验的研究

熊明峰，费 军，刘宏亮，余洪俊

导尿管留置体内所发生的导尿管相关性尿路感染(catherter-associated urinary tract infection，CAUTI)是常见的医院感染，在我国医院感染中的比例为20．8% ～31．7%，仅次于呼吸道感染［1］。而在美国为42%，日本则高达77%，均居医院感染的首位［2］。CAUTI的发生率随导尿管保留日数增加而呈直线上升，开放式尿道引流留置＞5天，无症状菌尿发生率为100%［3］。在保留导尿的病人中，30%出现有症状的尿道感染，100%出现无症状的菌尿［4］。尿路感染易并发肾盂肾炎、膀胱炎、感染性结石及继发性菌血症，造成患者住院天数延长及医疗费用增加。文献资料提示导尿病人菌血症的发生率是非导尿病人的5～8倍，由尿路感染引起菌血症及脓毒症占2% ～4%，其病死率为13% ～30%［5］。如何降低CAUTI是目前国内外临床研究的热点问题。

尿路感染绝大多数致病菌为革兰阴性肠道杆菌，常见的有大肠埃希菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、假单胞菌、肠杆菌、沙雷菌及念珠菌等［6］。留置导尿的感染菌和一般尿路感染的致病菌种类相同。卫生部全国细菌耐药性监测网(MOH National Antimicrobial Resistant InvestigationNet，Mohnarin)从男、女性尿标本中分离的菌株进行分析，其致病菌依然是以大肠埃希菌为代表的革兰阴性杆菌为主，但肠球菌等革兰阳性菌所占比例有所增多;致病菌对喹诺酮类、第3代头孢菌素的耐药率进一步升高，甚至达到了74．8%［7］。对耐药的细菌进行研究发现，产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌常同时携带多种耐药酶基因［8］，其中β-内酰胺酶、碳青霉烯酶仍是主要的耐药机制［9］。阿米卡星对革兰阴性杆菌仍保持较高的敏感率，对产ESBLs大肠埃希菌亦如此，敏感率约为83．3%［10］。

90年代初，专家们开始研究使用各种涂层导尿管，利用导尿管表面涂布材料的作用来减少相关感染。据报道，管外涂上水杨酸可抑制＞95%的革兰阳性杆菌，可防止细菌和酵母菌黏附在硅胶导尿管上，达到预防感染的目的［11］。另外，导尿管漆包一层银合金，可利用银所具有的广谱抑菌作用，减少菌尿发生［12］，尤其是对于短期使用导尿管的女性患者效果最好。但由于银合金导尿管的价钱较高，在临床使用受到了限制。基于这些研究基础，我们选择了价格低廉且耐药率相对较低的阿米卡星，制作负载有阿米卡星涂层的抗菌导尿管，希望在降低成本的同时，对CAUTI的防治也能发挥积极的作用。

材料与方法

1 仪器与试剂 (表1、2)

表1 试剂

表2 仪器

2 模型制备

2．1 普通导尿管处理 取20mm硅胶导尿管，在超声波清洗器中用75%乙醇溶液振荡清洗，去除导尿管表面杂质。干燥后在2%的戊二醛交联剂处理溶液中浸泡12小时，然后用去离子水冲洗去除多余的戊二醛。

2．2 复方壳聚糖导尿管制作 取2%乙酸溶液40ml，在50℃磁力搅拌下，缓慢加入0．5g壳聚糖，搅拌至溶液中无气泡;缓慢滴加0．4ml的4%丙三醇溶液，搅拌均匀后，再加入0．25%戊二醛溶液2．4ml，50℃磁力搅拌 30 分钟。

2．3 载缓释阿米卡星硅胶导尿管的制作 将经过表面预处理的硅胶管浸入壳聚糖溶液中，室温下浸泡6小时。然后，用垂直提拉机以40mm/min的速率从溶液中提拉出，室温下干燥10分钟。取20mg硫酸阿米卡星粉剂，均匀涂覆在硅胶导管上。然后再次将导管放入壳聚糖溶液中，用提拉机以同样的速率将导尿管提拉出。室温下自然干燥。

3 研究方法

3．1 能谱分析 采用1910FE环境扫描电子显微镜(ESEM)的能谱分析(EDAX)功能对膜层的实际元素组分进行检测，证实阿米卡星在导尿管上成功负载。

3．2 药物释放规律研究 将上述制备的载药涂层的硅胶尿管置于50ml烧杯中，加入50ml PBS溶液，在37℃恒温下进行体外静态释放实验，每隔一定时间(最初6小时，每1小时取材1次;24小时后每24小时取材1次)取5ml溶剂(取材后加入PBS溶液，补足50ml)，用分光光度计测定吸光度，绘制涂层中阿米卡星的释放曲线。

3．3 阿米卡星涂层的抗菌活性研究 选用大肠埃希菌标准菌株(ATCC25922)，稀释成0．5个麦氏单位，接种于M2H平板。将负载阿米卡星－壳聚糖的尿管、负载壳聚糖的尿管以及普通尿管直接置于平板上，37℃孵育24小时后观察尿管周围是否有抑菌圈产生。

结 果

1 负载阿米卡星-壳聚糖后的导尿管表面肉眼可以白色薄膜层(图1)

图1 导尿管样品大体外观图

2 图2为样品表面能谱分析图

图2a为干燥的普通导尿管的能谱图，通过分析得知样品表面主要元素为Si和O，因为导管主要材质为二氧化硅的水合物(SiO2nH2O)即硅胶。根据图2a中的元素含量表知O和Si的含量相当。图2b为负载阿米卡星-壳聚糖导尿管浸提前的能谱图。从元素含量表可知O含量比例远大于Si，这是因为一部分氧来源于壳聚糖分子。同时也检测到S元素，S来源于硫酸阿米卡星，说明药物成功包埋于壳聚糖膜层中。图2c为负载阿米卡星-壳聚糖导尿管浸提后，尿管表面未降解膜层处的能谱图。图2d为在PBS溶液中浸泡后的普通导尿管表面的能谱图，从两图的元素含量表中可知导尿管表面含有一定量的Na、Cl和P元素，主要来源于PBS溶液。但是图2c中Na和Cl含量高于图2d，这是因为导尿管表面尚未降解的壳聚糖膜层可以吸附NaCl，导致其表面Na和Cl含量较普通导尿管增多。

图2 不同导尿管样品表面能谱图

3 体外释放实验结果

药物释放曲线绘制:根据绘制的硫酸阿米卡星浓度标准曲线，得到拟合方程:Y=0．162+0．172X(Y为吸光度，X为被测溶液中硫酸阿米卡星浓度)。根据公式和溶液中吸光度值计算得到浸提液中硫酸阿米卡星的浓度，绘制成曲线。

图3中横坐标为浸泡时间天(d)，纵坐标为导尿管涂层中阿米卡星的累计释放量。导尿管表面15天释放阿米卡星量为10mg左右。当浸泡时间为1天时，导管药物释放量均达到5mg左右，约为载药量的一半，有一个突释过程。当5天时药物基本释放速率显著降低;5～13天释放曲线较平坦，但是13～15天药物释放速率又增加。

图3 载药导尿管药物缓释曲线(实际测量曲线)

4 带涂层导尿管的抗菌活性

将负载阿米卡星-壳聚糖的导尿管、仅负载壳聚糖的导尿管以及普通导尿管置于接种0．5个麦氏单位的大肠埃希菌的培养皿中，可见负载阿米卡星-壳聚糖尿管的周围有抑菌圈形成，而仅负载壳聚糖的导尿管以及普通导尿管周围没有抑菌圈形成(图4)，提示阿米卡星-壳聚糖涂层中的阿米卡星保持了抗菌活性。

图4 导尿管的直接抑菌实验

讨 论

几乎所有的手术患者均需要短期留置导尿管。在康复科、泌尿外科、骨科、神经科以及老年科，需要长期留置导尿的频率很高。CAUTI的感染途径主要是导尿管腔外感染和导尿管腔内感染。CAUTI病原菌的感染途径主要有，细菌沿导尿管外壁与尿道黏膜之间细菌性生物膜而上行(腔外感染途径);尿管与尿袋导管相连处污染及尿袋出口处污染(腔内感染途径)。由于尿道外口易受尿道分泌物、血迹、粪便污染，同时污染的衣裤、被褥，均可污染尿道外口周围黏膜和导尿管，同时由于每日2次会阴、尿道外口、导尿管近端消毒只能保持短时间的相对无菌，这样细菌可以通过污染的尿道外口及导尿管腔外途径感染［13］，目前众多研究者认为腔外途径是引起CAUTI的主要环节［14］。尿路感染细菌的生长有两种方式，一种是在尿液中浮游生长;一种在导管表面生长即生物膜性生长。细菌入侵并黏附于尿路上皮及导尿管表面，形成细菌性生物膜及导管的包壳(由细菌、细菌代谢物、蛋白质组成)，是CAUTI的一个重要特征，也是CAUTI难治又易复发的病理基础。导管表面的生物膜性包壳，构成了保护细菌的屏障，阻碍了抗生素对细菌的作用［15－16］。CAUTI的发生与导尿管保留时间有直接关系，且尿管留置时间越长，感染率越高。美国疾病预防控制中心的一项研究报告显示:导尿管留置1天，尿路感染率为1%;留置2天，感染率为5%;留置时间＞14天，感染率为100%［17］。这与我国多项研究报告的结果基本一致。

鉴于CAUTI的常见性、高发性和难治性，许多的研究投入到感染的预防工作中。目前临床预防和治疗CAUTI的主要方法有:(1)尽量减短留置导尿管的时间。但是，拔除尿管后，需要每日进行间断清洁导尿4～6次，明显增加医疗成本，增加护理工作量。同时反复导尿对尿道的刺激，非常容易造成尿道损伤，增加尿道挛缩、梗阻和菌血症的风险。(2)留置尿管后增加饮水量，每日进行膀胱冲洗，定期更换尿管。(3)对于已经发生的CAUTI，无排尿功能障碍的患者，在拔除尿管后常规抗感染治疗即可。但是对于存在排尿功能障碍的截瘫患者，尤其是存在膀胱感觉功能障碍的患者，在全身大剂量使用抗生素的同时是否拔除尿管是个困难的抉择。一种观点认为，拔除尿管，拔除膀胱和尿道中的异物，可以有效防止致病菌在异物表面的黏附，对控制感染是有效的。拔除尿管后用间断清洁导尿的方法排出尿液。但是因反复导尿，容易造成尿道损伤，有导致致病菌入血，发生菌血症的风险。另一种观点认为，继续留置尿管，可以使致病菌的培养基－尿液及时排出，同时便于膀胱冲洗，避免尿路损伤。但是留置在膀胱和尿道内的尿管，也便于致病菌的附着，容易形成生物膜，导致药物治疗失败。究竟孰优孰劣，目前还没有定论。最新的研究资料表明，在拔出尿管前预防性使用抗生素可以有效减少尿管拔出后尿路感染的发生率。如何正确有效的预防和治疗CAUTI，尤其是多重耐药致病菌所致的CAUTI仍然是目前临床医学所面临的迫切需要解决的非常重要的问题。

导尿管对人体是异物，当插入尿道并长期留置于尿道及膀胱内后，会刺激尿道及膀胱黏膜，破坏正常的生理环境，削弱尿道及膀胱对细菌的防御作用［18］，影响膀胱对细菌的正常冲刷作用。尿道内细菌的存留易引起尿路感染，减少尿道中的细菌，可以减少尿路感染的发生。盛晖等［19］设计制作了一种带Y形管的引流装置，通过该装置将苯扎溴铵溶液注入引流装置内，达到杀灭引流管内存在细菌的目的。经临床应用有效地控制了留置导尿管后的逆行尿路感染。带有抗菌素膜层的导尿管，由于膜层中的抗菌素可以逐渐释放，杀灭尿管周围的细菌，降低尿液中细菌的浓度，减少细菌在尿管壁上的黏附，从而减少生物膜的形成，最终达到减少CAUTI发生的目的。

在本研究中，我们采用壳聚糖为载体，将阿米卡星成功附着在硅橡胶导尿管的表面。壳聚糖本身可以降解成二氧化碳和水，是一种已经被批准用于人体的高分子材料。尿路感染的流行病学调查显示，阿米卡星仍然对CAUTI的主要致病菌大肠埃希菌等保持较高的敏感度，且阿米卡星抗菌谱广、不易诱导耐药且价格低廉，非常适用于局部使用。结果显示，我们所采用的方法没有破坏阿米卡星的抗菌性能，且阿米卡星逐渐从涂层内释放，抗菌效果维持一定长的时间。在13～15天药物释放速率增加，我们考虑与尿管表面本身对涂层的黏附性能有关。在制作过程中，我们采用两次涂膜的方法。肉眼观察，第一次涂膜后，尿管表面膜层均匀，光泽度好。但是第二次涂膜后，尿管表面的光泽度降低。不同的涂膜次数对涂层释放的影响还需要进一步研究。

本研究中所采用的制作方法可以用于制作载缓释阿米卡星－复方壳聚糖硅胶导尿管。该尿管在体外可以缓释有抗菌活性的阿米卡星。但是，导尿是引起医院尿路感染的直接因素，CAUTI的主要致病因素是导尿管与尿道间隙细菌逆行感染以及其它腔内感染途径，且感染发生与留置时间长短成正比。因此在临床上使用导尿管要有临床适应症状，同时应尽早拔出尿管行间断清洁导尿，尽量减少留置尿管造成的感染。在临床上对导尿管的材质及涂层改进，阻止细菌生长及细菌生物膜的形成，从而有效地降低必须留置尿管患者CAUTI的发生率，从而减少抗生素的使用，最终可以降低由此导致的抗生素耐药性的发生。

［1］邢玉斌，吕增春，朱士俊，等．医院感染现患率调查报告［J］．中华医院感染学杂志，2000，10(4):263 －265．

［2］ FoxmanB．Epidemiology of urinary tract infections:incidence，morbidity and economic costs［J］．Am J Med，2002，113(S1A):5－13．

［3］中野博．导尿引起的感染及其预防管理［J］．国外医学医院管理分册，1989，6(2):71．

［4］史清秀，韦真理，陈柳红．留置导尿管尿路感染的研究［J］．护士进修杂志，2000，15(8):592 －593．

［5］钟惟德．留置导尿管致尿路感染病原菌分布［J］．中华医现感染学杂志，2001，11(6):471 －473．

［6］黄梅花，徐万华，陈运生．留置导尿管致尿路细菌感染的临床研究［J］．齐齐哈尔医学院学报，2005，26(8):877－878．

［7］高磊，朱燕，肖永红．Mohnarin2008年度报告:男/女性尿标本细菌耐药监测研究［J］．中国抗生素杂志，2010，35(8):633－639．

［8］陈慧红，韩立中，余素飞，等．大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌超广谱β－内酰胺酶基因型研究［J］．中华医院感染学杂志，2008，18(2):160 －162．

［9］陈淑兰，路娟，宋熙瑶，等．常见非发酵菌的临床分布与耐药性分析［J］．中华医院感染学杂志，2008，18(4):589－591．

［10］王辉，陈民钧，倪语星，等．2003－2004年中国十家教学医院革兰阴性杆菌的耐药分析［J］．中华检验医学杂志，2005，28(12):1295 －1303．

［11］ Liedberg H，Lundeberg T，EkmanP．Refinements inthe coating of urethral catheters reduce the incidence of catheter－associated bacteriuria:anexperimental and clinical study［J］．Eur Urol，1990，17(3):236 －240．

［12］ Maki DG，Knasinski V，HalvorsonK，et al．A novel silverhydrogel impregnated indwelling catheter reduces CAUTIs:a prospective double－blind trial//Programs and abstracts of the Society for Healthcare Epidemiology inA-merica Annual Meeting［C］．Orlando，Florida，1998．

［13］ Maki DG，Knasinski V，Tambyah PA．Risk factors for catheter associated urinary tract infection:a prospective study showing the minimal effects of catheter care violations onthe risk of CAUTI［J］．Infect Control Hosp Epidemiol，2000，21:165．

［14］王菊延，张善芳，陈汝纯，等．复方阿米卡星凝胶预防留置尿管逆行感染的研究［J］．护理学杂志，2001，16(9):515－517．

［15］ Trautner BM，Darouiche RO．Role of biofilm incatheteassociated urinary tract infection［J］．Am J Infect Control，2004，32(3):177 －183．

［16］容桂荣．留置尿管伴随性尿路感染相关因素研究进展［J］．华夏医学，2002，15(5):703 －704．

［17］钟秀玲，李小瑛，罗艳霞，等．医院泌尿系感染危险因素分析与对策［J］．南方护理学报，2002，9(1):8 －9．

［18］胡美春．留置导尿患者尿路感染的原因分析及预防措施［J］．中华护理杂志，2003，38(8):645 －647．

［19］盛晖，钟云萍，刘瑛．Y形引流装置控制留置导尿管逆行尿路感染［J］．中华国际医学杂志，2001，1(6－7):568－569．