奶牛乳腺中瘦素及其受体的表达与定位

郭洪波，林叶，李庆章，边艳杰，肖阳

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

奶牛乳腺中瘦素及其受体的表达与定位

郭洪波，林叶，李庆章，边艳杰，肖阳

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

为探讨瘦素在奶牛乳腺发育、泌乳及退化各时期的表达变化规律及在乳腺组织中的具体位置，采用免疫印迹（westernblotting）技术及激光共聚焦技术检测奶牛乳腺组织中瘦素及瘦素受体（OB-Rb）的表达变化及其定位。结果表明，瘦素在青春期表达量较高，在泌乳期表达量最低。瘦素受体在青春期和妊娠期表达量较高，泌乳期表达量相对较低，退化期逐渐恢复到妊娠期水平。

奶牛；乳腺组织；瘦素；长型瘦素受体

0 引言

Zhang等[1]从遗传性肥胖小鼠的脂肪组织中采用位置克隆技术首次克隆出小鼠的肥胖基因（ob基因），瘦素是ob基因的产物，主要由白色脂肪组织分泌的分子量为16 ku的蛋白质[2]。瘦素受体属于Ⅰ型细胞因子受体超家族成员,长型瘦素受体（OB-Rb）在瘦素信号转导中起主要作用。瘦素缺失或瘦素受体缺失的小鼠乳腺导管分支明显减弱[3]。Lin等[4]发现瘦素可以促进小鼠妊娠期乳腺导管细胞的增殖和分化，诱导泌乳期β-酪蛋白基因表达，启动退化期乳腺细胞凋亡并参与乳腺组织重建过程。李萌等[5]在研究瘦素对奶山羊乳腺相关功能影响实验中也得出上述结论。本研究采用western blotting技术及激光共聚焦技术检测奶牛乳腺组织中瘦素及OB-Rb的表达变化及定位，为阐明瘦素及其受体在奶牛乳腺发育和泌乳过程中的作用机理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

澳大利亚荷斯坦奶牛奶牛按照实验要求在东北农业大学阿城实验动物养殖场饲养，取材备用。

实验分期：青春期2个月，青春期12个月，青春期14个月;

妊娠期2个月，妊娠期4个月，妊娠期6个月；

泌乳期7日，泌乳期50日，泌乳期140日，泌乳期280日；

退化期3日，退化期30日。

上述n=3。

青春期奶牛乳腺组织取材：青春期是从出生之日开始算起，分别取青春期2个月、12个月、14个月奶牛乳腺，液氮冻存备用。

妊娠期奶牛乳腺组织取材：公牛和母牛交配次日记为妊娠1日，之后每隔3天用验孕试纸检测是否妊娠，同时取材时通过腹腔解剖观察子宫状态进一步鉴定是否妊娠，妊娠90 d后直接从外观即可鉴定是否妊娠。分别取妊娠2个月、4个月、6个月奶牛乳腺，液氮冻存备用。

泌乳期奶牛乳腺组织取材：从分娩并开始泌乳日记为泌乳期，分别取泌乳7日、50日、140日、280日奶牛乳腺，液氮冻存备用。

退化期奶牛乳腺组织取材：泌乳结束后，即为自然退化3日、30日奶牛乳腺，液氮冻存备用。

1.1.1 试剂和仪器

试剂：Rabbit anti-bovine Ob（sc-842），Rabbit anti-bovine（Ob-R(H-300)，sc-8325），Goat anti–mouse FITC IgG sc-2092，Goat anti-rabbit IgG sc-2091，β-catemin mouse anti-bovine sc-2037，Mouse anti-bovine β-actin sc-47778，RAPI蛋白裂解液（P0013B），预染Marker（7～175ku），甲醇和冰乙酸等均为国产分析纯试剂，硝酸纤维素膜，PX型医用X-ray胶片，显影液，定影液等。

u ER1，仪器：激光扫描共聚焦显微镜（TCS SP2），半干转移电泳仪，冰冻切片机，电泳仪等。

1.2 方法

1.2.1 乳腺组织总蛋白提取

乳腺组织切碎，称重。1∶20倍加入苯甲基磺酰氟化物（PMSF）的RAPI裂解液对组织进行匀浆，冰上静置5 min，4℃下14 000 r/min离心15 min，收集上清液，进行后续western blotting实验。

1.2.2 免疫印迹分析（westernblotting）

分别取青春期、妊娠期、泌乳期和退化期奶牛乳腺组织提取总蛋白，瘦素分子量为16 ku，故选择5%的浓缩胶和15%的分离胶进行SDS-PAGE分析，长型瘦素受体选择5%的浓缩胶和8%的分离胶进行SDSPAGE分析。电泳结束后将凝胶上的蛋白转印到硝酸纤维素膜上，室温用脱脂牛奶封闭2 h，用3 mL 1∶500稀释的兔抗牛瘦素抗体4℃孵育过夜。取出后用TBST洗3次，每次5 min，再用3 mL 1∶5 000稀释的HRP-鸡抗兔IgG，37℃摇床孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min发光液显色，在暗室中曝光、显影。

1.2.3 乳腺中瘦素及其受体的表达定位

取青春期、妊娠期、泌乳期和退化期奶牛乳腺组织制作冰冻切片，冷丙酮固定10 min后用PBS洗3次，每次10 min，10%山羊血清37℃孵育60 min，兔抗牛瘦素抗体4℃孵育过夜（抗体用PBS稀释，稀释比例1︰100）。取出后用PBS洗3次，每次5 min，FITC-山羊抗兔IgG 37℃孵育60 min（稀释比例1︰200），PBS洗3次，每次5 min，DAPI染核15 min，PBS洗3次每次5min，用DABCO封片，激光共聚焦显微镜观察。阴性对照用PBS代替一抗。

1.3 数据处理和统计分析

免疫组化：对奶牛每个时期切片3张进行试验，每张切片选择不同视野进行观察，扫描拍照。Western blotting结果用bandscan4.3软件分析。所得数据均以平均数±标准差表示，同一样本不同处理的结果用SPSS统计分析软件进行t检验，多组数据之间应用SPSS统计分析软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 乳腺中瘦素及其受体的表达定量

图1为瘦素，OB-Rb，内参的Western blotting结果。图1中，V，P，L，I分别表示青春期，妊娠期，泌乳期和退化期；m代表月，d代表日，下同。

图2为奶牛乳腺中瘦素和OB-Rb的表达（P＜0.05）。由图2可以看出，瘦素在青春期表达量最高，并逐渐降低；在整个妊娠期瘦素表达量变化很小，略有升高；泌乳期瘦素维持在低水平；退化期表达量显著上调，到退化30 d瘦素表达量恢复到妊娠初期水平瘦素。

受体的表达量低于瘦素，表达变化规律与瘦素相类似。从而可以看出在乳腺发育、泌乳及退化的各个时期，瘦素的表达可正向诱导OB-Rb的表达。

2.2 奶牛乳腺中瘦素及其受体的表达定位

2.2.1 瘦素与β-catenin的表达定位

图2为奶牛乳腺中瘦素的表达定位。由图2可以看出，在青春期和妊娠早期，瘦素主要在乳腺脂肪细胞、大导管体细胞、帽细胞以及围绕导管的基膜中被检测到（图3 A～C）。妊娠期，在脂肪细胞、导管上皮细胞和基膜中检测到瘦素（图3 D,E）。泌乳期瘦素存在于腺泡上皮细胞靠近基底侧的部位以及细胞外基质中（图3 F～I）。在退化期，瘦素残留在导管上皮细胞和脂肪细胞中（图3 J,K）。

图3中，红色信号a是β-catenin；绿色信号b是leptin；蓝色信号c是细胞核；L是阴性对照。下同。

2.2.2 瘦素受体OB-Rb与β-catenin的表达定位

图3为奶牛乳腺中瘦素受体OB-Rb的表达定位。在青春期和妊娠早期，主要在乳腺脂肪细胞、大导管体细胞、帽细胞以及围绕导管的基膜中检测到OBRb（图3 A～C）。妊娠晚期，在脂肪细胞和导管上皮细胞中检测到OB-Rb（图3 D和E）。泌乳期，OB-Rb存在于腺泡上皮细胞靠近基底侧的细胞膜上（图3 F～I）。在退化期，OB-Rb存在于残留的导管上皮细胞和脂肪细胞中（图3 J和K）。

3 讨论

瘦素主要由脂肪细胞合成分泌，在奶牛乳腺组织中也同样如此[6]。青春期乳腺组织中瘦素及其受体的表达水平相对较高，这是由于青春期乳腺组织实体结构少，乳腺大部分被脂肪垫占据。妊娠期乳腺结构发生巨大改变，妊娠60～180 d乳腺以指数速率增加，分支小导管变长或变宽，脂肪组织迅速退化，乳腺中瘦素及其受体的表达量下降[7]。由于妊娠期缺少泌乳激素的作用，瘦素及其受体的表达量略有回升。这与Bonnet等运用免疫荧光技术对绵羊妊娠期乳腺中瘦素的定位研究结果相似[8]。泌乳期由于催乳素大量表达，瘦素及其受体的表达量维持在低水平。幼仔离乳后，乳腺退化在12 h内启动，随着乳腺实体组织的瓦解，乳腺脂肪垫重新生成，因此在退化阶段乳腺组织中瘦素及其受体的表达逐渐增加，到退化30 d已经恢复到妊娠初期的水平[9]。

瘦素及其受体的激光共聚焦结果证明：牛乳腺组织中瘦素，与小鼠、大鼠、人类细胞内一样具有自分泌和旁分泌的功能[10-12]。青春期瘦素除了在脂肪细胞中合成和分泌[13]，在导管上皮细胞和基膜中也检测到瘦素的存在。这是由于脂肪细胞能合成、分泌瘦素,瘦素反过来作用于下丘脑维持着体脂的稳定性。妊娠期乳腺组织进入主要的发育阶段，乳腺结构发生巨大改变。乳腺导管出现大量分支同时产生大量乳腺腺泡。直到分娩并开始泌乳，乳腺发育达到最大程度。妊娠早期，乳腺发育缓慢，此时乳腺中瘦素的表达含量变化不大。在这一阶段，瘦素主要在脂肪细胞和导管上皮细胞中被检测到。在泌乳期，乳腺导管末端完全发育成功能性腺泡，并维持腺泡结构和功能。乳腺腺泡由单层上皮细胞围成的空腔组成，外周由网状肌上皮细胞包围，肌上皮细胞外被由结缔组织组成的基膜围绕。腺泡之间填充着由纤维原细胞、白细胞和其它结缔组织细胞组成的基质，并伴有血管穿过基质间的空隙。此时瘦素主要在乳腺腺泡上皮细胞中表达，说明乳腺上皮细胞可以合成和分泌瘦素[4]。在乳腺退化过程中，乳腺组织功能性结构迅速消退，乳腺腺泡由于细胞凋亡的启动而瓦解。此时瘦素主要在脂肪细胞和残存的导管上皮细胞中被检测到。

青春期，OB-Rb在脂肪细胞和导管上皮细胞中表达。Laud等[14]用RT-PCR方法证明，在妊娠和泌乳期绵羊乳腺中有长型和短型瘦素受体的表达，原位杂交结果显示瘦素受体转录本在乳腺上皮细胞中特异性表达。O'brien[15]研究结果表明乳腺上皮细胞是瘦素合成和分泌的部位。妊娠期，随着导管的发育，乳腺脂肪垫逐渐退化，在妊娠60～120 d，OB-Rb在脂肪细胞和导管上皮细胞中被检测到；妊娠180 d，乳腺脂肪垫消失，功能性腺泡形成，OB-Rb专一性地在腺泡上皮细胞的细胞膜上表达。泌乳期，OB-Rb在腺泡上皮细胞的细胞膜上被检测到，但其表达水平很低。同时乳腺中瘦素的表达也很弱，表明在泌乳期瘦素的功能不是维持乳腺结构、乳汁合成和分泌所必需的。退化期，OB-Rb在脂肪细胞和残留的导管上皮细胞中表达。由于腺泡结构的瓦解和乳腺脂肪垫的重新生成，乳腺中OB-Rb的表达回升。在这一阶段，瘦素是启动退化期乳腺细胞凋亡的主要细胞因子，退化期瘦素功能性受体的高表达也说明瘦素在泌乳结束后乳腺组织重建的过程中必不可少[5]。

4 结论

奶牛乳腺整个发育过程中瘦素和瘦素受体的表达，青春期最高，妊娠期下降，泌乳期维持在低水平，退化期显著升高，在退化30 d恢复到妊娠初期水平。瘦素及其受体在乳腺不同时期细胞中分布变化表明，瘦素专一性诱导OB-Rb的表达，且通过与OB-Rb的结合调控乳腺的发育和生理功能。

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Expression and localization of leptin and its receptor in mammary gland of dairy cow

GUO Hong-bo,LIN Ye,LI Qing-zhang,BIAN Yan-jie,XIAO Yang
(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The protein expression and localization of leptin and its long form receptor(OB-Rb)were detected by western blottig methord and a confocal laser scanning microscope.The results showed that leptin protein level was higher in virgin,the lowest in lactation.Then OB-Rb was higher in virgin and pregnancy,lower in lactation,and recovered to the original level in involution.

dairy cow;mammary gland;leptin;OB-Rb

TS252.1

A

1001-2230（2011）06-0008-04

2011-01-20

国家自然科学基金资助项目（30671538）；东北农业大学创新团队项目（CXT005-1-1/CXT005-1-2）。

郭洪波（1984-），女，硕士研究生，研究方向为动物生物化学与分子生物学。

李庆章