盐酸多西环素对重组质粒 pBI-EGFP-hHO-1表达的调控

杨 婧 张海风 王 媛 赵 勤 张新胜 单 杰

(郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室,河南 郑州 450001)

癌症已经成为威胁人类健康的一大重要疾病,目前通常采用化疗、放疗、手术切除等方法进行癌症的治疗。但是癌症的治疗一般都很困难,并且预后不佳〔1〕。血色素氧化酶-1(HO-1)是哺乳动物细胞中广泛存在的一种可诱导酶,它是血色素在机体内被降解过程中的限速酶〔2〕,具有抗氧化,抗凋亡等效应,是细胞内重要的保护酶类,并与肿瘤的发生发展有很大关系。有研究表明在大部分癌症组织里,HO-1蛋白表达变得很高〔3〕,同时机体内对抗外界氧化作用的其他酶如超氧化物歧化酶(SOD)、超氧化氢酶 (CAT)等的表达和活效都有或高或低的下降〔4,5〕。这说明 HO-1在癌症的发生发展过程中可能起到了保护癌细胞的作用。Tet-off调控系统具有效能高、毒副作用小,并有严谨“开关”功能的优点,能够表达连接在其上的目的基因。可通过四环素类和盐酸多西环素〔强力霉素类 (Dox)〕药物对该系统进行诱导。前期的研究中构建 HO-1的真核表达载体,但该表达载体并不能人为地有效调控目的基因的表达。本实验采用 Tet-off调控表达系统载体,构建一个能够人为调控目的基因 HO-1表达的真核表达载体 pB I-EGFP-hHO-1,为后续实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 限制性核酸内切酶 NheⅠ、MluⅠ(Freg Ments公司产品);限制性核酸内切酶 HindⅢ、BamHⅠ、Marker DL2000、10×Loading buffer、T4 DNA连接酶、核酸胶回收试剂盒 (TaKa-Ra公司产品);质粒小量提取试剂盒 (AxyPrep公司产品);Taq DNA聚合酶、dNTP、lipofectamine2000脂质体转染试剂、TR IZOL Reagent(Invitrogen公司产品);RPM I1640培养粉 (G IBCO公司产品);胰蛋白酶 (Sigma公司产品);小牛血清 (杭州四季青公司);cDNA第一链合成试剂盒 (B IORED公司产品);兔抗人HO-1多克隆抗体、兔抗人β-Actin抗体 (SANTA CRUZ产品);S-P免疫组化试剂盒 (中杉金桥生物工程公司);盐酸多西环素(江苏联环药业股份有限公司);质粒 pcDNA3.1-hHO-1、质粒pB I-EGFP、质 粒 pTet-off(由 本 室 保 存);细 菌 菌 株(E.Coli.DH5α)(由本室保存 );人肝癌 (S MMC7721)细胞系(由本室保存)。

1.2 方法

1.2.1 质粒 pB I-EGFP-hHO-1的构建 将本室保存的含有质粒 pcDNA3.1-hHO-1的 E.Coli.DH5α划板过夜,挑取单个菌落于 50 mlLB培养基中,37℃摇床培养过夜,提取质粒,用 HindⅢ和 BamHⅠ双酶切得到 HO-1小片段,电泳鉴定为约 800 bp。之后取上述 pcDNA3.1-hHO-1质粒作为 PCR扩增模板,在引物中添加 NheⅠ和MluⅠ酶切位点扩增 HO-1片段,电泳后回收。用NheⅠ和 MluⅠ双酶切 37℃分别处理回收的片段和质粒 pB IEGFP,琼脂糖凝胶电泳后分别胶回收 pB I-EGFP大片段和HO-1小片段。纯化后将片段在 T4连接酶作用下进行连接。连接产物转化感受态细菌。提取重组质粒后用 NheⅠ/MluⅠ双酶切鉴定。

1.2.2 重组质粒 pB I-EGFP-hHO-1在肝癌细胞 S MMC-7721中的表达

1.2.2.1 细胞培养及转染 使用含 10%小牛血清的 RPM I1640培养基,将肝癌 S MMC-7721细胞在 37℃,5%CO2培养箱中培养。以适当密度接种在 25 ml培养瓶中,待细胞贴壁后密度达到 90%～95%时,使用 lipofectamine2000脂质体按照说明书将重组质粒转染进转染组。

1.2.2.2 RT-PCR鉴定重组质粒 pB I-EGFP-hHO-1表达 以适当密度接种在 25 ml培养瓶中,分为三组：①阳性对照即未转染质粒组。②转染空载质粒 pB I-EGFP、Tet-off组。③转染重组质粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-off组。转染后 48 h分别提取细胞总RNA。使用B IORED公司 cDNA第一链合成试剂盒合成 cDNA第一链。取上述产物 2μl作为 PCR扩增模板,设计特异性引物扩增 HO-1基因序列中约 110 bp特异片段,同时扩增内参对照β-actin片段,2%琼脂糖凝胶电泳,分析 RT-PCR扩增结果。1.2.2.3 免疫细胞化学鉴定 Tet-off调控的 pB I-EGFP-hHO-1的蛋白表达 细胞以适当密度接种在 25 ml培养瓶中,分为四组①未转染质粒组,②转染质粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-Off组。①、②组又分别设立其阴性对照组①-a、②-a(即由 PBS取代第一抗体)。待转染 48 h后,做免疫细胞化学。光电显微镜下观察免疫细胞化学结果。

1.2.3 不同浓度盐酸多西环素诱导 Tet-off调控的 pB I-EGFP-hHO-1在细胞中的表达 待细胞贴壁,密度达到 90%～95%,将25 ml培养瓶中细胞分别标记为 1～9号,将 Tet-off和 pB I-EGFP-hHO-1共转染进肝癌 S MMC-7721细胞,24 h后分别加入不同浓度的盐酸多西环素溶液 ,依次为：1、5、10、50、100、500、1 000、2 000、3 000 ng/ml。48 h后分别提取细胞总 RNA,同时提取 1瓶未转染细胞作 RT-PCR,2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。

2 结 果

2.1 质粒 pB I-EGFP-hHO-1的构建 NheⅠ/MluⅠ双酶切重组质粒后电泳可见约 5 100 bp及约 866 bp条带,与质粒 pB IEGFP及 HO-1基因序列长度相一致。说明已将质粒 pB I-EGFP-hHO-1构建成功。见图1。

图1 重组载体质粒 pBI-EGFP-hHO-1酶切鉴定结果

2.2 重组质粒 pB I-EGFP-hHO-1在肝癌细胞 S MMC-7721中的表达

2.2.1 RT-PCR鉴定重组质粒 pB I-EGFP-hHO-1表达 以βactin mRNA的表达作为内参对照,检测三组 HO-1的 mRNA的表达：①未转染质粒的阴性对照组;②转染 pB I-EGFP、Tet-off空质粒组;③转染质粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-Off组。结果显示：以内参引物为引物经 RT-PCR扩增后可见约 427 bp电泳条带,半定量分析三组细胞中β-actin mRNA表达在凝胶电泳图条带亮度上无显著差异,这说明三组细胞提取的总 RNA量相等。以特异性引物经 RT-PCR扩增后见到约 110 bp电泳条带,且③组的 HO-1特异片段的mRNA比①、②组明显增高。可判断四环素调控 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-Off系统在肝癌细胞 S MMC7721中 HO-1 mRNA的表达增高。见图2。

图2 RT-PCR检测 HO-1基因 mRNA在SMMC-7721细胞中的表达

2.2.2 免疫细胞化学鉴定 Tet-off调控的 pB I-EGFP-hHO-1的蛋白表达 ①-a、②-a细胞上未见棕红色染色。①、②组细胞均有红棕色,且②组中一部分细胞红棕色染色明显深于①组。说明 Tet-Off调控的 pB I-EGFP-hHO-1在肝癌细胞 S MMC7721中 HO-1蛋白质的表达增高。见图3。

2.3 不同浓度盐酸多西环素诱导 Tet-off调控的 pB I-EGFP-hHO-1在细胞中的表达 检测 10组 HO-1mRNA的表达。①未转染质粒阴性对照组②-⑩分别为转染质粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-off 24 h后加入 1、5、10、50、100、500、1 000、2 000、3 000 ng/ml盐酸多西环素溶液组。结果显示：当盐酸多西环素溶液浓度达到 2 000 ng/ml时转染质粒 pB I-EGFP-hHO-1、Tet-off组的 HO-1含量接近阴性对照组,即 Tet-off调控得 pB I-EGFP-hHO-1的盐酸多西环素诱导浓度为 2 000 ng/ml。见图4。

图3 免疫细胞化学检测 HO-1蛋白质在 SMMC-7721细胞中的表达

1～11：1,5,10,50,100,500,1 000,2 000,3 000 ng/ml多西环素组 ;未转染质粒组;Marker

3 讨 论

HO-1在机体遭遇机体氧化或应对外界刺激的时候保护细胞,但恰恰这种保护作用在化学药物治疗或射线放射治疗癌症时,HO-1却变成了癌细胞的保护酶,使疗效降低甚至失去疗效。当肿瘤治疗达到恢复阶段时,化学药物治疗和放射射线治疗产生的氧化自由基会继续作用于机体的正常健康细胞,如果这些氧化自由基不能及时清除,癌症患者会恢复缓慢甚至诱发新的肿瘤,如果在适当的时候能够增强 HO-1的表达,就可以保护正常细胞。鉴于以上种种,本文试图找到安全有效的方法来调控 HO-1的表达。

本实验采用的 Tet-off系统,是目前应用最广泛的诱导性基因表达系统,它具有在机体内外都能进行基因表达调控的优点〔6〕,可以用于原核生物体,真核生物体模型。其诱导物四环素类和强力霉素类价格低廉,毒性小,使其正逐渐成为一种较为理想的诱导性基因表达系统。该系统包含调控质粒和应答质粒,调控质粒 Tet-off,质粒中含有一个融合的转录活化因子结构 tTA,该因子由细菌的四环素阻遏物 TetR和人类单纯疱疹病毒 (HSV)的 VP16转录激活蛋白融合而成〔7〕,进一步修饰后能被四环素类及衍生物诱导并激活。应答质粒 pB I-EGFP,质粒上含有一个 Pbi-1的结构,该结构包含 Tet反应性元件 TRE(包含细菌四环素操纵子DNA序列 TetO)和人类巨噬细胞立早启动子 PminCMV-1和 PminCMV-2,PminCMV-1启动子后有多克隆位点,可以插入外源目的基因,PminCMV-2接有 EGFP绿色荧光蛋白基因〔8〕。当诱导因子 (四环素类衍生物)不存在时,tTA中 TetR成分和 TetO序列结合,通过 VP16发挥转录活性,启动目的基因及荧光蛋白基因转录。加入诱导因子后,诱导因子与 tTA结合使其从 TRE上脱落,终止目的基因和荧光蛋白基因的转录。从而实现在外源诱导因子的作用下认为的控制目的基因的表达或关闭,并同时有绿色荧光蛋白作为报告基因〔9〕。

有资料表明〔10〕,盐酸多西环素的半衰期比四环素长,即相同剂量的盐酸多西环素与四环素相比能够在体内存在更长的时间,发挥药效的时间更长,因此本实验中选取盐酸多西环素作为诱导剂。

在本实验中 Tet-off作为调控质粒,pB I-EGFP作为应答载体,选用盐酸多西环素作为诱导剂。采用定向克隆将 PCR扩增的目的基因 HO-1片段插入到真核表达载体 pB I-EGFP中,将构建好的 pB I-EGFP-hHO-1质粒与调控质粒 Tet-off双转染进肝癌细胞 S MMC-7721中,48 h后检测 HO-1在 mRNA和蛋白水平的表达情况。采用 RT-PCR方法检测加入不同浓度的盐酸多西环素后,重组质粒中 HO-1的表达,得到 Tet-off调控的 pB IEGFP-hHO-1的盐酸多西环素诱导浓度为 2 000 ng/ml。载体构建成功,以及盐酸多西环素对该 Tet-off调控系统诱导浓度的确定,为下一步实验奠定了基础。

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10 Shaikh S,Souise F,Nicholson LF.Optimization of the tet-on system for inducible expression of RAGE〔J〕.J Biomol Tech,2006;17(4)：283-92.