SB203580对小鼠造血组织辐射损伤的保护作用

翟志斌，王月英，张 恒，吴红英，李德冠，路 璐，常建辉，王小春，孟爱民

(北京协和医学院 放射医学研究所 天津市分子和医学重点实验室，天津 300192)

SB203580对小鼠造血组织辐射损伤的保护作用

翟志斌，王月英，张 恒，吴红英，李德冠，路 璐，常建辉，王小春，孟爱民

(北京协和医学院 放射医学研究所 天津市分子和医学重点实验室，天津 300192)

目的 观察SB203580对接受γ射线照射的C57BL/6小鼠造血组织损伤的保护作用。方法 小鼠随机分为对照(Ctr)组、照射(IR)组及SB203580给药(SB)组，以6.0 Gy137Csγ射线全身均匀照射SB组和IR组的C57BL/6小鼠。收集并计数外周血红细胞、白细胞和血小板，以及单侧股骨骨髓有核细胞(BMMNC);骨髓细胞半固体培养法检测BMMNC增殖能力。另外收集小鼠BMMNC，同样分组，IR组与SB组细胞进行1 Gy体外照射，照射之后孵育过夜，酶标仪检测细胞内活性氧(ROS)水平。结果 SB组外周血白细胞、血小板的数量分别比IR组高111.8%和157.7%(P ＜0.05);SB 组 BMMNC 较 IR 组高135.4%，CFU-GM 高188.5%(P ＜0.05);SB 组 BMMNC内ROS较IR组低56.2%(P＜0.05)。结论 SB203580对照射造成的小鼠造血组织损伤具有一定的保护作用，这种保护作用可能与其降低照射后细胞内ROS水平有关。

SB203580;骨髓有核细胞;单核-粒细胞集落形成单位;活性氧

造血组织是一类辐射敏感组织，电离辐射造成造血组织损伤可导致贫血、出血和免疫力降低，是核辐射事故与放射治疗中患者死亡的主要原因之一。电离辐射可使DNA造成损伤，同时激活应激通路。p38 MAPK是重要的应激通路蛋白。电离辐射可能通过作用于机体产生的活性氧(ROS)激活 p38 MAPK，导致组织损伤［1］。本文选择p38MAPK的特异性抑制剂SB203580，通过外周血细胞与骨髓有核细胞计数，以及集落形成实验观察其对于血液系统的保护作用，另外，通过 ROS实验初步探讨SB20358对造血组织起到保护作用的机制，为研发相关辐射防护剂提供实验依据。

1 材料

SB203580购自LC Laboratories;ROS检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所;甲基纤维素培养基购自Stemcell Technology有限公司;Ficoll淋巴细胞分离液购自天津美德太平洋有限公司。

SPF级C57BL/6小鼠，雄性，体重20～22 g，由维通利华实验动物有限责任公司提供，合格证号:SCXK(京)2002-0003。

日本sysmex poch-100i全自动血液分析仪;瑞士TECAN公司infinite2000多功能酶标仪。

2 方法

2.1 照射条件

137Csγ射线进行一次性全身6.0 Gy照射(辐射源购自加拿大原子能有限公司)，剂量率为0.88 Gy/min;体外照射股骨骨髓有核细胞(BMMNC)，照射剂量为 1 Gy，剂量率为 0.76 Gy/min。

2.2 分组及给药

将C57BL/6小鼠分为对照(Ctr)组、照射(IR)组和SB203580给药(SB)组，每组10只。对照组接受假照射，其余2组进行剂量为6.0 Gy的γ射线一次性全身照射。SB组于照射前30 min腹腔注射SB203580 15 mg/kg，照射后24 h继续给药，隔日1次，共5次，Ctr组和IR组给予等体积二甲亚砜(DMSO)。

2.3 观察指标与方法

2.3.1 细胞计数 末次给药24 h后，眼静脉丛取血，计数红细胞、白细胞和血小板。另取小鼠一侧股骨，2 mL注射器吸取含2%胎牛血清的D-Hanks液1 mL冲洗股骨，得到骨髓细胞悬液，用血细胞分析仪计数BMMNC。

2.3.2 单核-粒细胞集落形成单位(CFU-GM) 末次给药24 h后，取双侧股骨，用注射器吸取含2%胎牛血清的D-Hanks液冲洗，收集骨髓细胞。计数后加入甲基纤维素培养基中，接种至24孔板内。于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养6 d。于第6天，在倒置显微镜下计数阳性集落(细胞数＞30的细胞集落为阳性集落)。结果以每105细胞形成的阳性集落数来表示。

2.3.3 ROS 另取正常C57BL/6雄性小鼠6只，处死后取双侧股骨，用注射器吸取含2%胎牛血清的D-Hanks液冲洗，收集骨髓细胞。骨髓细胞经Ficoll密度梯度离心得到BMMNC，将细胞分为Ctr组、IR组和SB组，每组含1×106细胞，其中IR组和SB组接受1 Gyγ射线照射，SB组在照射前在37℃、5%CO2，含 1μmol/L SB203580的培养基内孵育30 min，Ctr组与IR组接受与SB组等量的DMSO。接受照射之后各组细胞接种至24孔板，在37℃、5%CO2，饱和湿度的条件下过夜。样本处理依照检测试剂盒使用说明，多功能酶标仪在激发光波长为488 nm，发射光波长为525 nm的条件下检测细胞内DCF荧光强度。DCF荧光强度反映细胞内ROS水平。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 SB203580缓解电离辐射导致的血液细胞数目下降

结果见表1。6 Gy一次性全身照射的小鼠(IR组)外周血红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板较Ctr组分别低29.9%，97.1%和 95.4%(P ＜0.01);经SB203580干预之后(SB 组)，RBC、WBC、血小板较 Ctr组分别低 29.9%，93.9% 和 88.0%(P ＜0.01)，与 IR 组比较，WBC 高 111.8%(P ＜0.05)，血小板高157.7%(P ＜0.01)。

3.2 SB203580对骨髓有核细胞的保护作用

结果见表1。6 Gy一次性全身照射的小鼠(IR组)BMMNC 较 Ctr组低80.9%(P ＜0.01);CFU-GM较 Ctr组低 95.7%(P ＜0.01);给予 SB203580 后(SB 组)，BMMNC 比 Ctr组低86.2%(P ＜0.01)，比IR组高 135.4%(P ＜0.01)，CFU-GM 比 Ctr组低55.0%(P ＜0.01)，比 IR 组高 188.5%(P ＜0.05)。说明SB203580可以抑制小鼠全身照射后引起的造血功能下降。

3.3 SB203580的抗氧化作用

ROS的测定结果见表1。经1 Gyγ射线照射后，IR组BMMNC内 ROS较 Ctr组高69.5%(P＜0.05);SB组BMMNC内ROS产生较IR组低56.2%(P ＜0.05)。

表1 SB203580预防给药对小鼠全身照射血液系统的保护作用( s，n=10)Tab.1 The effects of SB203580 on blood system in C57 mice with irradiation(，n=10)

表1 SB203580预防给药对小鼠全身照射血液系统的保护作用( s，n=10)Tab.1 The effects of SB203580 on blood system in C57 mice with irradiation(，n=10)

与 Ctr组比较:1 P ＜0.05，2 P ＜0.01; 与 IR 组比较:3 P ＜0.05，4 P ＜0.01Compared with Ctr group:1 P ＜0.05，2 P ＜0.01;Compared with IR group:3 P ＜0.05，4 P ＜0.01

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4 讨论

受到放射损伤后的机体大多会出现贫血、感染和出血等症状，并且，外周血RBC、WBC、血小板数目低下。外周血细胞数目低下与造血组织损伤密切相关。损伤后血液功能和造血功能的恢复依赖于残存的具有造血功能的BMMNC的数目和能力。我们通过实验观察到SB203580可以缓解电离辐射导致的WBC和血小板数目下降，另外，SB203580可以缓解单侧股骨BMMNC数目的下降，还通过反映造血祖细胞的增殖能力的CFU-GM实验观察到SB203580可以缓解电离辐射导致的骨髓造血功能抑制。SB203580表现出对造血组织具有一定的辐射保护作用。

目前，尽管多项研究显示p38 MAPK接到的信号转导通路在自身免疫性疾病、糖尿病、肿瘤、阿尔兹海默病和心血管疾病的发生发展过程中起到重要作用［2］，SB203580可以通过抑制凋亡相关信号通路中的关键因子Bax蛋白的移位，抑制缺血性心肌病引发的心肌细胞凋亡［3］，但SB203580对电离辐射诱导的骨髓损伤的保护作用还鲜有报道。本次实验为期10余天，实验小鼠正处于辐射损伤的急性期，电离辐射所致细胞凋亡是造成造血组织损伤的主要原因。而SB203580除了可以抑制p38 MAPK活性，我们的实验还发现它可以在短期内通过抑制细胞内ROS的生成。Ichijo等［1］研究显示电离辐射产生的ROS可以通过激活p38 MAPK上游激酶ASK1引发细胞凋亡，我们的实验显示SB203580可能通过抑制细胞内ROS的产生，从而抑制凋亡相关信号转导，保护造血组织。

同时，在临床实践中，电离辐射对骨髓造血功能的长期抑制是辐射损伤患者死亡的重要原因之一。我们的前期实验［4-6］发现caspase-3的抑制剂z-VAD可以抑制电离辐射诱导的造血细胞凋亡，但是对于辐射诱导的骨髓细胞增殖能力长期抑制只有部分纠正，而这种长期抑制由造血干细胞的永久性损伤所导致。Ito等［7］研究表明 ROS可以通过激活 p38 MAPK，可长期抑制造血干细胞的功能，提示SB203580不仅可以抑制凋亡保护骨髓造血功能，它还可能具有缓解电离辐射导致的造血功能的长期抑制的作用。接下来我们将会进一步观察SB203580对电离辐射诱导的骨髓造血功能长期抑制是否具有保护作用，并探讨相关的分子机制。

［1］Ichijo H，Nishida E，Irie K，et al.Induction of apoptosis by ASK1，a mammalian MAPKKK that activates SAPK/JNK and p38 signaling pathways［J］.Science，1997，275(5296):90-94.

［2］Cuenda A，Rousseau S.p38 MAP-kinases pathway regulation，function and role in human diseases［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1773(8):1358-1375.

［3］Capano M，Crompton M.Bax translocates to mitochondria of heart cells during simulated ischaemia:involvement of AMP-activated and p38 mitogen-activated protein kinases［J］.Biochem J，2006，395(1):57-64.

［4］Wang Y，Schulte B A，LaRue A C，et al.Total body irradiation selectively induces murine hematopoietic stem cell senescence［J］.Blood，2006，107(1):358-366.

［5］Meng A，Wang Y，Brown SA，et al.Ionizing radiation and busulfan inhibit murine bone marrow cell hematopoietic function via apoptosis-dependent and-independent mechanisms［J］.Exp Hematol，2003，31(12):1348-1356.

［6］Meng A，Wang Y，Van Zant G，et al.Ionizing radiation and busulfan induce premature senescence in murine bone marrow hematopoietic cells［J］.Cancer Res，2003，63(17):5414-5419.

［7］Ito K，Hirao A，Arai F，et al.Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells［J］.Nat Med，2006，12(4):446-451.

The protective effects of SB203580 on hematopoietic tissue exposed to irradiation

ZHAI Zhi-bin，WANG Yue-ying，ZHANG Heng，WU Hong-ying，LI De-guan，LU Lu，CHANG Jian-hui，WANG Xiao-chun，MENG Ai-min
(Tianjin Key Laboratory of Molecular Nuclear Medicine，Institute of Radiation Medicine，Peking Union Medical College，Tianjin 300192，China)

Purpose To investigate the protective effects of SB203580 on hematopoietic tissue of C57BL/6 mice injured by γ-ray.Methods Male C57BL/6 mice were randomly divided into control group(Ctr)，irradiation group(IR)and SB203580 treatment group(SB).Mice were intraperitoneal injected SB(15 mg/kg)30 minutes ahead of TBI and then given every 2 days for 5 times after the TBI.On day 11，peripheral blood count and nucleated femoral cell count were performed by blood analyzer.1 × 105cells were seeded into Methocult GF M3534 methylcellulose medium and colony-forming units-granulocyte and monocyte(CFU-GM)were scored on day 6.DCFH as a fluorescent probe assessed the reactive oxygen species(ROS)generation in overnight incubated bone marrow mononuclear cells(BMMNC)，which were irradiated at 1 Gy.Results Transitory and significant changes occurred in the cell amount of BMMNCin the irradiated mice after administration of SB203580:white blood cells，platelets and BMMNC in SB were significantly increased by 111.8%，157.7%and 135.4%(P ＜0.05).The proliferation suppression of BMMNC in IR group was eased by SB203580 injection and CFU-GM in SB group score rises by 118.5%(P ＜0.05).Moreover，ROSgets back to the normal level observed in SB group.Conclusion It was shown that changing with cell count and enhancing of proliferation manifested the protection of SB203580 from radiation induced hematopoietic tissue injury.The protection of SB203580 may attribute to its suppression on ROSgeneration.

book=86,ebook=18

SB203580;bone marrow mononuclear cells;colony-forming unit-granulocyte and monocyte;reactive oxygen species

R962

A

1005-1678(2011)02-0085-03

2010-09-20

国家自然科学基金资助项目(30828011，30770645);天津市自然科学基金资项目(08JCYBJC07300)

翟志斌，男，在读硕士研究生;孟爱民，通信作者，研究员，博士生导师，E-mail:ai-min-meng@126.com。