稻壳中黄酮类化合物的微波提取及其抗氧化活性研究

(佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007)

稻壳中黄酮类化合物的微波提取及其抗氧化活性研究

张羽男,苏宏宏,江 惠,李亚菲,黄 强,刘 楝,孙 旭,周 维,胡月茹,李泽涵

(佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007)

目的:研究稻壳中总黄酮的最佳提取工艺及其抗氧化作用。方法:提取工艺采用微波法,以总黄酮提取率为考察指标,选用L9(34)表进行正交试验;抗氧化试验采用Fenton反应法和烘箱储藏法,通过比较吸光度和POV值研究其抗氧化活性。结果:最佳的提取条件为乙醇浓度70%,提取时间120s,固液比1g¨10mL,微波功率700 W,提取率可达0.313%;抗氧化试验结果表明,稻壳中提取的总黄酮具有较强的清除羟基自由基能力和阻断猪油自氧化作用的能力。结论:稻壳中提取的黄酮类化合物具有良好的抗氧化活性。

稻壳;黄酮类化合物;微波提取法;抗氧化性

稻壳又名碧糠或大糠,按质量计约占稻谷的20%,是碾米厂的主要副产品之一。每年我国稻壳年产量可达8000多万吨,但由于稻壳本身密度小,难于运输和贮存;外壳坚硬,不易被土壤消化;营养价值低,不适合作饲料;所含纤维短,不适合造纸,常被视为废弃物而燃烧掉,没有被很好地开发和利用[1]。然而,研究表明,稻壳中含有许多如黄酮、低聚木糖及绿原酸等具有较高药用价值的活性成分[2]。其中,黄酮类化合物具有抗氧化、抗突变、抗衰老、抗肿瘤、降血脂及治疗心脑血管疾病等多方面的生理功效[3,4]。因此,如何综合有效地利用废弃稻壳生产具有医用保健功能的黄酮类化合物,就极具学术意义和经济价值。本研究以稻壳为原料详细研究了微波提取分离黄酮类化合物的方法与条件,建立了最佳提取与纯化工艺,并对其抗氧化活性进行了研究,为利用废弃稻壳工业化生产黄酮类药用保健成分提供科学依据。

1 材料、试剂、仪器

1.1 主要材料

原料:水稻谷壳,简称稻壳,来源于黑龙江省桦南县。

试剂:芦丁标准品,上海生化制剂厂。三氯甲烷、KI、H2O2、冰乙酸、FeSO4、NaOH、水杨酸等均分析纯。

1.2 主要仪器

RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);FA 2004电子天平(上海恒平科学仪器有限公司);格兰仕G70D20N 1L-M1(SO)微波炉(格兰仕公司);Spectrum lab-54型紫外-可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)等。

2 实验方法

2.1 芦丁标准曲线的绘制

精密称取芦丁对照品25.0mg,80%乙醇溶解后,移至100mL容量瓶,定容。精密吸取2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0mL分置于50mL容量瓶中,分别加入5%NaNO2溶液1.5mL,混匀,放置6min,加入10%的Al2(SO4)3溶液1.5mL,混匀,放置6min,加4%NaOH溶液20mL,加水至刻度,摇匀,放置15min。在510nm 的波长处测定其紫外吸光度。以吸光度值(A)为纵坐标,芦丁溶液的浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线。

2.2 原材料的预处理

本试验所用稻壳来源于黑龙江省桦南县农户,采用乙醇作为溶剂。当乙醇作溶剂时,不可避免的将脂溶性色素一起提取出来,这将对结果分析带来不必要的干扰,故原料预先进行石油醚脱脂、脱色素,以排除干扰。具体方法为:将稻壳清洗干净,置于60℃恒温干燥箱内进行烘干(24h),取出后粉碎过筛,然后将稻壳用索氏提取法(石油醚为抽提剂,80℃水浴浸泡)除去米糠油等脂溶性物质,当虹吸管中石油醚提取液无色时,减压过滤,取滤渣并将残留在其中的石油醚挥尽。再用不同浓度的乙醇溶液作为溶剂提前浸泡稻壳24h,备用。

2.3 提取条件的正交设计

为全面考察微波提取法的工艺参数及最佳操作条件,按照正交表L9(34)安排四因素三水平的正交试验,如表1所示。

表1 试验因素水平表

2.4 稻壳中提取黄酮的工艺流程

原料的预处理→称取40g干燥粉末→浸提剂浸泡24h→微波法提取→冷却→抽滤→浓缩→棕色容量瓶定容→避光保存备用。

2.5 提取物的精制

采用萃取法对提取物进行精制。将提取液放在旋转蒸发器中减压浓缩至1/3后将滤液在80℃水浴上蒸干,所得固体加入水10mL溶解,再加入三氯甲烷10mL,振摇,转入分液漏斗,静置分层,弃去三氯甲烷层,水溶液再加入三氯甲烷10mL(重复1次),将水层减压蒸馏,浓缩,水浴蒸至近干,干燥得精制品,备用。

2.6 提取物的定性检验

采用显色法进行黄酮的定性检验。称取一定量的精制品,溶于80%乙醇配成浓度为5%的溶液。利用盐酸-镁粉,4%NaOH溶液及1%FeCl3溶液的显色反应,观察其颜色变化。

2.7 Fenton反应法[5]测定稻壳中总黄酮的抗氧化能力

取5支带塞的试管,依次编号。每支试管分别加入9mmol/L的FeSO4溶液1mL,9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液2mL,按试管编号各加入不同浓度的黄酮水溶液2mL,最后加入8.8mmol/L的H2O2溶液2mL进行反应,放于在37℃下水浴条件下反应1h,以蒸馏水代替黄酮水溶液作空白对照,在510nm处测定样品的吸光度,记录数据。其清除自由基的清除率可用公式表示如下:

式中:AS为加入提取液后的吸光度;A 0为空白对照液的吸光度;A为溶液本身的吸光度。

2.8 稻壳中黄酮类化合物在猪油中的抗氧化作用

采用烘箱储藏法测定提取物对猪油自氧化的抗氧化能力。猪油由市售板油在烧杯中用文火熬炼而成。称取粗黄酮粉0.05、0.10、0.20g,各用5mL浓度为60%乙醇溶解后分别加到20.00g温热猪油中,搅匀,以不加稻壳黄酮粉,仅在20.00g猪油中加入60%乙醇5mL为对照样,在(65±1)℃烘箱中强化保存,每隔2d取样测定猪油中的过氧化值(POV值),并以此来表示猪油的氧化速度,进而衡量稻壳中黄酮类化合物的抗氧化活性。样品的过氧化值(POV)计算:

式中:POV为样品的过氧化值,mmol/kg;V 1为试样消耗硫代硫酸钠标准溶液体积,mL;V 2为空白试验消耗硫代硫酸钠标准溶液体积,mL;N为硫代硫酸钠标准溶液的摩尔浓度,mol/L;0.1269为1mg硫代硫酸钠相当碘的克数;W 为试样的质量,g。

3 结果与分析

3.1 芦丁标准曲线的绘制

标准曲线如图1所示。进行线性回归,得回归方程:y=5.5045x+ 0.0053(r= 0.9974)

图1 芦丁标准曲线

3.2 正交试验结果与分析

微波法提取稻壳中的黄酮类化合物的正交试验结果如表2所示,各种因素对黄酮提取量影响的主次顺序为:微波时间＞乙醇浓度＞微波功率＞固液比,最佳的提取条件为乙醇浓度70%,提取时间120s,固液比1g¨10mL,微波功率为高火(700 W),即A 3B2C2D3。经验证实验得出该条件下黄酮类化合物的提取率为0.313%。

表2 微波法提取黄酮类化合物正交实验结果

3.3 提取物的定性检验结果

稻壳提取物与盐酸-镁粉反应产生橙色泡沫;与NaOH反应,溶液变黄色;与FeCl3反应,生成墨绿色溶液。表明稻壳提取物中可能含有黄酮类、黄酮醇类、双氢黄酮类等多种黄酮类化合物。

3.4 抗氧化活性研究

3.4.1 稻壳中黄酮化合物清除羟基自由基的活性

黄酮类化合物可作为金属离子螯合剂,阻断Fenton反应系统中自由基的生成。按照实验方法测定吸光度,并计算清除率,结果见表3。

表3 稻壳中黄酮类化合物对羟基自由基的清除率

由表3可以看出,稻壳中总黄酮提取液对由Fenton体系产生的·OH有一定的清除作用,随着总黄酮提取液浓度的增加,对自由基(·OH)的清除能力也增强.当提取液浓度达到1.5%时,提取液对羟自由基的清除作用达到最大。

3.4.2 POV值测定法

不同浓度的样品POV值随时间变化情况如表3。可以看出,相对于对照样,在猪油中添加不同质量的黄酮粉,均可显著抑制猪油的自动氧化,表现比较强的抗氧化性。而且随着添加量的增加,抗氧化能力也随之增强。总体来看,添加量越大抗氧化效果越好。

表4 稻壳中黄酮类化合物对猪油的抗氧化作用

4 讨论

本实验通过设计正交试验确定了微波法提取稻壳中黄酮类化合物的最佳提取条件:乙醇浓度70%,提取时间120s,固液比1g¨10mL,微波功率700 W。抗氧化性的研究表明稻壳中黄酮类化合物具有较强的清除自由基能力和显著的抗猪油过氧化作用,且在一定浓度范围内,稻壳黄酮类化合物浓度越大,其抗氧化性越强。

[1]吴彬,马正智,周伟,等.从稻壳中提取制备低聚木糖研究进展[J].中国食品添加剂,2009,94-100

[3]孔琪,吴春.菊花黄酮的提取及抗氧化活性研究[J].中草药,2004,35(9):1001-1002

[4]陈乃富,张莉.蕨菜黄酮类化合物的提取与分析[J].中国林副特产,2004,(6):1-4

[5]李贵荣.枸杞多糖的提取及其对活性氧自由基的清除作用[J].中国现代应用药学杂志,2002,19(2):94-96

R284

A

1008-0104(2011)06-0083-02

2011-09-20)

佳木斯大学大学生科技创新项目,编号:Dz2011-057。

张羽男(1979～)男,黑龙江佳木斯人,博士,讲师,研究方向为天然药物化学。