乳清蛋白的酶法改性研究

李 慧 石金波刘小翠

（1山西大同大学农学与生命科学学院，大同 037009） （2山西省农科院高寒区作物研究所，大同 037008）

·基础研究·

乳清蛋白的酶法改性研究

李 慧1*石金波2**刘小翠1

（1山西大同大学农学与生命科学学院，大同 037009） （2山西省农科院高寒区作物研究所，大同 037008）

采用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶在各自的最适条件下对乳清蛋白粉进行水解，通过HPLC方法测定酶解产物中α-乳白蛋白（α-La）和β-乳球蛋白（β-Lg）的含量。结果表明，碱性蛋白酶对其水解最快，其次为木瓜蛋白酶，而在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下则不易酶解，而且发现α-La比β-Lg更容易水解。

乳清蛋白；α-乳白蛋白；β-乳球蛋白；酶解；高效液相色谱

乳清蛋白（Whey Protein） 是牛奶中的一种主要蛋白质，其含量仅次于酪蛋白，占牛奶中蛋白质质量的18%～20%。其中β-乳球蛋白（β-Lg）和α-乳白蛋白（α-La）是乳清蛋白的主要成分，分别占其质量的40%～50%和10%～20%左右。乳清蛋白具有较高的营养价值及功能特性，一直以来被广泛的应用于食品工业。但乳清蛋白又是一种常见的过敏原，其中β-乳球蛋白是引起牛乳过敏的主要成分，其次为α-乳白蛋白。目前主要通过蛋白质改性的方法来控制和消除乳清蛋白过敏原。

蛋白酶催化乳清蛋白水解是降低过敏反应的一种有效的方法。蛋白酶通过水解乳清蛋白的抗原决定部位，可以消除或降低其抗原性，降低牛乳过敏反应。同时可以产生一系列具有生物活性的肽，还能改善其功能特性，促使营养组成更趋合理、风味更为突出。水解产物可作为食品原料或添加辅料应用于营养配方食品、保健品、疗效食品、临床营养品、速溶饮品及方便食品，从而拓宽蛋白质应用范围，提高蛋白质使用价值，还可满足消化道蛋白酶分泌不足患者、老年人、运动员、肥胖症患者、婴儿等特殊人群需要。

本文采用几种最常用的蛋白酶水解乳清蛋白，通过HPLC方法测定水解产物中α-La和β-Lg含量，以这两种蛋白的水解速率为指标，筛选出最快酶解α-La和β-Lg这两种过敏原的酶作为最佳用酶，为牛乳蛋白过敏患者尤其是婴幼儿过敏患者开发低过敏或无过敏的乳蛋白制品提供方法和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

乳清蛋白粉（WPC 80），蛋白质质量分数为72.8%,水分质量分数为6.1%，美国Proliant公司；碱性蛋白酶（Alcalase 2.4L），诺维信公司；木瓜蛋白酶 （Papain 18），广州远天；风味蛋白酶（Flavourzyme 500MG），诺维信公司；中性蛋白酶，Amresco公司；复合蛋白酶（Protamex），诺维信公司；胰蛋白酶（trypsin）、胃蛋白酶（pepsin），sigma公司；L-酪氨酸，BDH Chemicals Ltd Poole England。

1.2 仪器与试剂

Sartorious电子分析天平，德国；THZ-82恒温振荡器，常州国华电器有限公司；DYCZ-24D双垂直电泳槽、DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂；高效液相色谱仪（SPD-M10AVP），日本岛津公司；752紫外光栅分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；792-双向磁力加热搅拌器，江苏省金坛市医疗仪器厂；pHS-25型pH计，上海精科雷磁。

β-乳球蛋白标准品、α-乳白蛋白标准品、色谱纯乙腈，sigma公司；三氟乙酸，北京津益化工厂。

硼砂、硼酸、氢氧化钠、乳酸、乳酸钠、甲醛均为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白水解工艺流程

选取碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶7种蛋白酶在各自最适的条件下进行水解，水解条件见表1。

表1 水解用酶的最适反应条件

称取一定量的乳清蛋白粉，根据各种酶的最适pH，选取不同的缓冲液做溶剂配置成质量浓度为80 g/L的乳清蛋白粉溶液加入反应容器中。达到酶解温度后，按照1 000 U/g加入相应的酶，在最适条件下水解30 min。反应在恒温水浴振荡器中进行。反应到终点用1 mol/L的HCl调节pH到2，钝化酶。胃蛋白酶水解终点时加1 mol/L的NaOH调节pH到12使酶失活。

1.3.2 测定方法

HPLC法测定α-La和β-Lg的条件：Kromasil C8反相色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相为A：体积分数0.1%的TFA水溶液，B：体积分数0.09%的TFA乙腈溶液梯度洗脱。流动相B在10 min内从20%上升到50%，然后用10 min从50%上升到80%，在2 min内由80%降到20%。流速为0.8 mL/min；二极管阵列检测器，检测波长：215 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。

水解度的测定采用甲醛滴定法。

蛋白酶活力的测定采用紫外分光光度法。

α-La和β-Lg酶解率计算方法：

式中：m1——酶解前的含量；

m2——酶解后的含量。

2 结果与讨论

2.1 蛋白酶活力的测定

测得各蛋白酶的活力见表3。酶活是反应酶水解底物的能力，本试验对各种蛋白酶的考察均按相同的酶活力加酶，即在相同的条件下考察了各种蛋白酶对α-La和β-Lg的水解能力。

表2 蛋白酶酶活力

2.2 不同蛋白酶水解物中α-La和β-Lg的含量

用HPLC方法分析了各种蛋白酶的酶解产物。图1为样品未酶解的HPLC图谱，图2是胃蛋白酶的酶解图谱，其他酶解图谱略。比较酶解前后的图谱可以看到，乳清蛋白粉经过酶解后，α-La和β-Lg的含量比酶解前降低，而且在α-La和β-Lg的峰前产生许多小峰，说明酶解后产生了大量的肽段。

图1 样品的高效液相色谱图

图2 胃蛋白酶酶解样品的高效液相色谱图

通过HPLC方法测定了各种蛋白酶在其最适条件下酶解后水解物中α-La和β-Lg的含量。经过计算得出其酶解率，结果见图3。

由图3可以看出，除胃蛋白酶外，其他6种酶对α-La的酶解率都为100%；而只有碱性蛋白酶将β-Lg彻底酶解，其余均未完全酶解。可知α-La比β-Lg更容易水解。对于β-Lg，碱性蛋白酶对其水解最快，其次为木瓜蛋白酶，而在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下β-Lg不易酶解。因此，本试验选择碱性蛋白酶为最适用酶，该酶是一种微生物蛋白酶，来源广泛、活力比较高、水解速度快、成本低，是较理想的工业用酶。而且该酶为液体酶，容易与底物充分作用。

图3 不同蛋白酶作用下α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的酶解率

乳清蛋白酶解的速率主要与其结构有关，乳清蛋白由于具有二硫键，不易被消化酶即胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，乳清蛋白的不易消化性是造成其容易引起过敏的原因。碱性蛋白酶则是内肽酶，主要催化由疏水性氨基酸的羧基形成的酰胺键，可水解蛋白质分子内部的肽键，生成相对分子质量较小的多肽，因而能破坏蛋白质分子内部的抗原结合位点，有效降低蛋白的过敏原性。本试验的研究结论与前人研究结果一致。Mota等人曾比较了胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶对乳清蛋白粉中β-Lg和α-La的水解速率，结果表明碱性蛋白酶速率最高。Wroblewska等发现可以利用碱性蛋白酶水解乳清蛋白，降低乳清蛋白的抗原性，以此来制备低致敏牛奶。沈小琴等人比较了几种不同酶水解乳清蛋白，发现碱性蛋白酶降低乳蛋白抗原性的效果最佳。

2.3 不同蛋白酶水解物的水解度

本试验采用甲醛滴定法测定不同蛋白酶水解物的水解度，结果见图4。

图4 不同蛋白酶水解物的水解度

由图4可以看出，碱性蛋白酶水解物的水解度最大，表明碱性蛋白酶水解能力最强；其次为木瓜蛋白酶；胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解度最小。以水解能力作为选择蛋白酶的评价指标时，应选择碱性蛋白酶，因其水解能力最强，酶的反应速度快，能满足实际生产的要求。但在采用碱性蛋白酶水解乳清蛋白过程中多采用限制性酶解，即在使α-La和β-Lg水解的前提下，要尽量控制其水解度，主要原因是蛋白质充分酶解不仅会使成本增加，而且酶解产物的风味变差。蛋白质充分酶解后形成的游离氨基酸吸收比多肽的吸收差，而且影响产物的功能特性，使其乳化性及稳定性变差。

3 结论

本试验采用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶7种蛋白酶水解乳清蛋白粉，通过HPLC法定量测定，比较了不同种类的蛋白酶在其最适条件下酶解乳清蛋白后，酶解产物中α-La和β-Lg的含量。试验结果表明：α-La比β-Lg更容易水解；7种蛋白酶中碱性蛋白酶对α-乳白蛋白和β-乳球蛋白水解最快，其次为木瓜蛋白酶，而在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下则不易酶解。最终筛选出碱性蛋白酶作为水解β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的最适用酶。

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Study on the enzymatic modification ofwhey protein

LI Hui1*SHI Jin-bo2**LIUXiao-cui1
1（College ofagriculture and life science，Shanxi Datonguniversity，Datong037009，China）2（High latitude crops institute toShanxi academyofagriculture science，Datong037008，China）

Whey protein concentrate（WPC）were hydrolyzed by seven proteases respectively,they were alcalase,papain,flavourzyme,protamex,neturase,pepain and trypsin.The degradation of α-Lactalbumin（α-La）and β-Lactoglobulin（β-Lg）were determined by HPLC.Results indicated alcalase was observed to be the fastest degradation of α-La and β-Lg.The second was papain.Pepain and trypsin hydrolysis rate was slow.α-La hydrolyzed easier than β-Lg.

whey protein； α-Lactalbumin；β-Lactoglobulin；proteolysis；HPLC

TS252.42

A

1673-6004（2011）04-0043-04

*李慧，女，1981年出生，2006年毕业于中国农业大学食品科学专业，助理工程师。

**石金波，通讯作者：Email：shijinbo2009@163.com.

2011-07-05