高效液相色谱法测定奥沙利铂注射液中奥沙利铂的含量和有关物质

闫占宽, 李语如, 宋晓光, 梁喜珍

(1.江苏恒瑞医药股份有限公司,江苏连云港 222002;2.东华理工大学化学生物与材料科学学院,江西抚州 344000)

高效液相色谱法测定奥沙利铂注射液中奥沙利铂的含量和有关物质

闫占宽1, 李语如1, 宋晓光1, 梁喜珍2

(1.江苏恒瑞医药股份有限公司,江苏连云港 222002;2.东华理工大学化学生物与材料科学学院,江西抚州 344000)

建立以高效液相色谱法测定奥沙利铂注射液中的奥沙利铂有关物质和含量的方法,以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,规格 250 mm×4.6 mm,粒径 5μm,以水-甲醇(90∶10)为流动相,流动相用 0.45μm的膜过滤,紫外检测波长为250 nm。奥沙利铂在50～1 600μg/ml的浓度范围内,峰面积与浓度呈线性关系,线性曲线方程为 A=3 650.9C+17.095(r=0.9999),最低检测限为 1.2 ng。加样平均回收率为 99.4%(RSD=0.81%,n=9)。本方法简便、灵敏、准确,可用于奥沙利铂注射液中的有关物质和含量的控制。

高效液相色谱法;奥沙利铂;有关物质;含量测定

奥沙利铂是继顺铂和卡铂之后,由瑞士Debiopharm公司研制开发的第三代铂类抗癌药。化学名为左旋反式二氨环已烷草酸铂,它与顺铂的抗肿瘤谱不完全相同,体外和体内的临床研究表明,奥沙利铂在 15min内可完成全部与 DNA结合,无蓄积毒性,对肾脏无损害,肠癌的细胞株和耐顺铂的细胞株等多种肿瘤,有显著的抑制作用。奥沙利铂属于新的铂类药物(刘小平等,2007),在水中微溶,在甲醇中极微溶,在乙醇中几乎不溶;可用液相色谱对奥沙利铂的有关物质 (郭德嵩等,1999;靖士侠等,2002;姚智东等,2003;任鹏等,2005)、含量进行测定。本文建立了高效液相色谱法测定奥沙利铂注射液中的有关物质和奥沙利铂的含量,该方法操作简单、准确、重现性好。

1 仪器和试药

仪器。Agilent 1100 Pump系统,DAD检测器,Agilent ChemStation色谱工作站 (安捷伦科技有限公司),电子天平(BP110S,赛多利斯)。

试剂。甲醇 (色谱纯,江苏汉邦科技有限公司),30%过氧化氢 (分析纯,上海桃浦化工厂);盐酸(分析纯,溧阳市东方化学试剂厂);氢氧化钠(分析纯,上海市化学试剂有限公司);亚硫酸氢钠(分析纯,宜兴市亚盛化工厂);纯化水 (江苏恒瑞医药股份有限公司自制);奥沙利铂对照品(欧洲标准品,批号:LOT n02);奥沙利铂注射液 (批号:05082247,05122347,06020647江苏恒瑞医药股份有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用反相色谱法,用碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,水-甲醇 (90∶10)为流动相,检测波长为250 nm。奥沙利铂与其中的有关物质分离良好,主峰保留时间合适,峰形对称,可用来测定奥沙利铂注射液中的有关物质和含量 (国家药典委员会,2004)。

2.2 辅料的干扰试验

在上述色谱条件下,按制剂处方制成辅料溶液,进样分析,色谱图见图 1,辅料溶液在 2.4 min左右产生一个溶剂峰,但不影响有关物质的测定。

2.3 破坏性实验

取奥沙利铂注射液适量,按下表方法进行光照、酸、碱、加热、氧化、还原破坏性实验,用上述色谱系统检查降解产物,色谱图见图 2,测定结果见表1。

2.4 有关物质的测定方法

取奥沙利铂注射液适量作为供试品溶液,取供试品溶液适量,用水稀释制成每 1 ml中含 20μg的溶液作为对照溶液。量取对照液 10μl,注入液相色谱仪,调节仪器检测灵敏度,使主成份色谱峰高约为满量程的 20%。量取供试品溶液 10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图至主峰保留时间的 2.5倍,量取峰面积,按面积归一化法和自身对照法计算有关物质的量。测定结果见表 2。

表1 奥沙利铂注射液的降解情况表Tab.1 Degradation information card of oxaliplatin injection

表2 有关物质测定结果Tab.2 Related substance determ in consequence

面积归一化法和自身对照法分别计算奥沙利铂注射液的有关物质,测定结果基本一致。

2.5 含量测定

2.5.1 系统适用性试验

用碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,水-甲醇 (90∶10)为流动相,检测波长为 250 nm,理论板数按奥沙利铂计算不低于 2 000。

2.5.2 线性曲线的测定

取奥沙利铂对照品适量,加水溶解并稀释至刻度,摇匀。取此溶液适量,用水稀释成浓度分别为1.6,0.8,0.4,0.2,0.1,0.05 mg/ml的溶液,分别精密量取上述溶液各 20μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,量取峰面积。以峰面积 (A)为纵坐标,进样浓度(C)为横坐标,进行线性回归,线性曲线为A=3650.9C+17.095,r=0.999 9。

图3 奥沙利铂的标准曲线Fig.3 The oxaliplatin standard curve

2.5.3 检测限和定量限的确定

在本实验条件下,取线性曲线下 0.05 mg/ml的溶液适量,稀释至浓度为 0.2μg/ml的溶液,进样 20μl,以信噪比 S/N=10计算,奥沙利铂的定量限为 4 ng;将定量限下溶液稀释至浓度为 0.06μg/ml的溶液,进样 20μl,以信噪比 S/N=3计算,奥沙利铂的检测限为 1.2 ng。

2.5.4 含量测定的精密度和溶液的稳定性

(1)含量测定的精密度。移取奥沙利铂注射液适量,用水稀释制成每 1 ml中含 0.4 mg的溶液作为供试品溶液;另取奥沙利铂对照品适量,精密称定,用水溶解制成每 1 ml中含 0.4 mg的溶液作为对照品溶液。分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各 20μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,量取峰面积。按外标法计算样品的含量及计算含量的相对标准偏差RSD,考察该测定含量方法的精密度。含量测定的精密度试验 RSD%=1.8(n=6),含量平均值为 100.3%,表明该方法的精密度好。

(2)溶液的稳定性试验。取精密度测定项下的溶液进行稳定性试验,分别测定溶液放置 1,4,8 h后的含量。结果表明,奥沙利铂注射液溶液稳定性的RSD%=0.17(n=4),表明溶液在 8 h内稳定。

2.5.5 回收率试验

按10瓶处方量,精密称取相当于 80%,100%,120%主药量的主药和空白辅料液,混合均匀后作为回收率样品。分别精密称取回收率样品适量,加水溶解并稀释成每 1 ml中约含 0.4 mg的溶液作为供试品溶液;另取奥沙利铂对照品适量,精密称定,用水溶解制成每 1 ml中含 0.4 mg的溶液作为对照品溶液。分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各 20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,量取峰面积。按外标法计算样品的回收率,平均回收率为99.4%,RSD%=0.81(n=9)。

2.5.6 含量测定方法

精密移取奥沙利铂注射液适量,用水制成每 1 ml中含 0.4 mg的溶液作为供试品溶液;另取奥沙利铂对照品适量,精密称定,用水溶解制成每 1 ml中含0.4 mg的溶液作为对照品溶液。分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各 20μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,量取峰面积。按外标法计算样品的含量。三批样品 05082247,05122347,06020647的含量测定结果分别为:98.2%,100.4%,99.8%。

3 讨论

对采用不同组成和比例的流动相的分离结果进行了比较,结果表明,以甲醇 -水(10∶90)为流动相时分离效果较好。在本色谱条件下,能够很好地检测出有关物质及降解产物。因此,采用本色谱条件来测定奥沙利铂注射液中奥沙利铂的含量和有关物质,该方法操作简单、准确、重现性好。

郭德嵩,陈世铭.1999.第三代铂类抗癌药物奥沙利铂的研究进展[J].国外医学药学分册,10(1):4-8.

国家药典委员会.2004.国家新药转正标准第 35册[S].171-172.

靖士侠,柳月安.2002.奥沙利铂的药理作用与临床应用[J].中国医院药学杂志,22(3):171-172.

刘小平,耿丹清,石炳光,等.2007.奥沙利铂脂质体中奥沙利铂的含量测定[J].中国医药导报,4(25):101-102.

任鹏,孙坚彤,沈云玉,等.2005.反相高效液相色谱法测定奥沙利铂的含量[J].抗感染药学,2(1):24.

姚智东,吴洪斌.2003.奥沙利铂的安全性评价[J].中国新药杂志,12(7):567-569.

Oxaliplatin Determ i nation of Oxaliplatin I njection L iquid by High Performance L iquid Chromatography

YAN Zhan-kuan1, L I Yu-ru1, SONG Xiao-guang1, L I ANG Xi-zhen2
(1.Jiangsu HengruiMedicine Co.,LTD,Lianyungang,JS 222000,China;2.Faculty of ChemistryBiology andMaterial Science,East China Institute of Technology,Fuzhou,JX 344000,China)

To establish the determination method of related substances and content of oxaliplatin injection by high perfor mance liquid chromatography(HPLC).HPLC is performed to determine octadecylsilyl silica gel chromatography column,250 mm ×4.6 mm,diameter 5μm,The mobile phase ismethanol-water(10∶90),mobile phase by 0.45μm membrane filter,the detectingwavelength is 250 nm.The detected concentration of oxaliplatin is in the good linear range of 50～1 600μg/ml(r=1.000 0),the li mitof detection is 1.2 ng,and the average recovery is 99.4%(RSD=0.81%,n=9).The established method is si mple,sensitive,accurate and available for the quality control of oxaliplatin.

high perfor mance liquid chromatography;oxaliplatin;related substances;content assay

R927.2

A

1674-3504(2010)03-290-03

10.3969/j.issn.1674-3504.2010.03.13

2009-08-31

闫占宽 (1975—),男,工程师,主要从事质量管理和质量控制工作。E-mail:yanzhankuan@163.com