低温β-半乳糖苷酶菌株的筛选

马宏伟 ，王聪 ，胡立新 ，*

（1.内蒙古蒙牛阿拉乳制品有限责任公司，北京 101107；2.湖北工业大学化学与环境工程学院，湖北 武汉 430068）

低温β-半乳糖苷酶菌株的筛选

马宏伟1，王聪2，胡立新2，*

（1.内蒙古蒙牛阿拉乳制品有限责任公司，北京 101107；2.湖北工业大学化学与环境工程学院，湖北 武汉 430068）

从内蒙古宝格达山高山冻土以及乳制品中分离到25株嗜冷菌，利用产低温β-半乳糖苷酶的模型筛选，获得1株低温酶高产菌株C。在以乳糖为主要碳源的发酵培养基中，该低温酶的最适pH值为6.4，最适作用温度为32℃，不同金属离子对酶活影响：Mn2+＞Mg2+＞K+＞Na+＞Ca2+＞Fe2+＞Cu2+＞Zn2+。4 ℃相对酶活为总酶活的 30%。

乳制品；嗜冷菌；低温β-半乳糖苷酶；酶学性质

新鲜乳制品的冷藏保鲜加工以及生产低乳糖牛奶与乳制品需要在低温条件下具有高活性的β-半乳糖苷酶[1]，但目前低温生产所用的常温β-半乳糖苷酶的酶活力都很低而且成本较高[2]，难以满足市场及生产所需。为解决相关问题，应首先着手于对低温β-半乳糖苷酶菌株的分离筛选[3]。分离筛选出低温分解乳糖高酶活菌株[4]，并对其低温β-半乳糖苷酶性质进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

由内蒙古宝格达山高山冻土中分离纯化得到。

1.1.2 培养基

试验所用培养基：牛奶分解培养基（乳糖25 g，脱脂牛奶 10 g，琼脂 2 g，蒸馏水 100 mL，pH 7.0），淀粉分解培养基（乳糖25 g，酵母粉5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，可溶性淀粉 20 g，琼脂 25 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0），Tween80分解培养基（乳糖25 g，蛋白胨20 g，NaCl 10 g，CaCl2·7H2O 0.2 g，Tween8020 mL，琼脂 30 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0），纤维素分解培养基（乳糖25 g，蛋白胨 20 g，酵母粉 10 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaC110 g，CMC—Na 15 g，琼脂 25 g，蒸馏水 1000 mL，PH 7.0）。

1.1.3 仪器

数码型生物显微镜XSP-13CD：上海豫光仪器有限公司；723PC分光光度计上海精密仪器仪表公司；恒温水浴箱：WHC-15宁波赛福实验仪器厂；V型温度计：常州市新华仪表厂；PH-8414便携式PH计：广州市铭睿电子科技有限公司。

1.2 菌株的分离

将内蒙古宝格达山冻土样品取1 g放入500 mL的富集培养基中，于15℃，150 r/min，摇床培养3 d。取富集菌悬液，稀释涂布于选择培养基上，15℃培养2 d，挑选单菌落，测定乳糖酶活性并进行复筛。

1.3 产低温酶菌株的筛选[5]

划线培养牛奶分解培养基平板上，在5℃培养3d～5 d后观察在平板上是否有半透明分解圈。划线培养淀粉分解培养基平板上，在5℃培养6 d后观察在平板上是否有无透明分解圈。将划线培养Tween80分解培养基平板上，在5℃培养1周～2周后观察菌体周围有无模糊的晕圈。划线培养纤维素分解培养基平板上，在5℃培养3周后，滴加1 mg/mL刚果红染色1 h，再用1 mol/L的NaCl稀溶液冲洗平板，观察能否在菌落周围形成半透明的分解圈。

1.4 生长温度试验[6]

分别将复筛得到菌株接种于20 mL培养基中，并于15℃，150 r/min一级培养。再将培养的菌悬液20 μL手工接至10 mL新鲜液体培养基中，分别在温度5、10、15、20、25、30 ℃下振荡培养，通过 3、6、9、12、15 h后测定菌悬液在420 nm处的吸光值。

1.5 β-半乳糖苷酶最适pH值的测定

配制pH值4～9的磷酸钠缓冲溶液，于420 nm处测定不同pH值下的酶活。

1.6 不同金属离子对β-半乳糖苷酶活的影响

在最适pH下，考察各种金属离子，在吸光值420nm处测定酶活。

2 数据与分析

2.1 内蒙古宝格达山冻土嗜冷菌的分离

在5℃下取内蒙古宝格达山不同深度的多年冻土样品，分析分离结果见表1，嗜冷菌数量在距地表180 cm深度的冻土样品中的数量最多，并且土样深度的增加，冻土样品中分离出来的菌落多样性增多。

表1 内蒙古宝格达山冻土样品中可培养嗜冷菌的数量Table1 Inner Mongolia bogd mountain permafrost samples can be cultured from the number of psychrophilic bacteria

2.2 β-半乳糖苷酶的酶学性质研究

2.2.1 内蒙古宝格达山冻土嗜冷菌的生长温度特性

选取实验室保藏的1株中温菌作为对照菌株，32℃时为最适生长温度。25株嗜冷菌在25℃～38℃左右是最适生长温度，在4℃时都可以生长，而在33℃下大多数菌株不生长，属于典型的嗜冷菌。

2.2.2 β-半乳糖苷酶最适pH值测定

在不同的反应pH值条件下测定的酶活结果见图2。由图可知，该酶的最适pH值为6.4。低温β-半乳糖苷低温酶偏酸性，这与目前报道的低温β-半乳糖苷酶的最适pH偏碱性有一定差异。

2.2.3 不同金属离子对低温β-半乳糖苷酶活的影响用最适pH的不同金属离子溶液稀释酶液，在最适温度条件下，测定酶活。试验结果表2所示。

表2 不同金属离子对β-半乳糖苷酶活的影响Table2 Effects of metal ions on β-galactosidase activity

Mg2+、Mn2+、K+、Na+对低温 β-半乳糖苷酶有激活作用，对该酶的影响为：Mn2+＞Mg2+＞K+＞Na+，Mn2+激活作用最为明显；Zn2+、Cu2+对低温β-半乳糖苷酶有抑制作用，对该酶的影响为：Cu2+＞Zn2+。Na+、K+、Mn2+可提高酶活约40%～55%，而Zn2+、Cu2+抑制酶活15%左右。

2.3 内蒙古宝格达山冻土嗜冷菌产低温酶菌株的筛选

从25株嗜冷菌中筛选得到具有产2种低温酶特性的菌株为 C1、C3、C8、C18、C23、C25，具有产 3 种低温酶的特性的菌株为C2，结果如表3所示。C2不仅能够产3种低温酶并且具有较高活性。

表3 产低温酶菌株的筛选Table3 Screening of strains producing low-temperature enzyme

3 结论

在以乳糖为主要碳源的发酵培养基中，该低温酶的最适pH值为6.4，最适作用温度为32℃，不同金属离子对酶活影响：Mn2+＞Mg2+＞K+＞Na+＞Ca2+＞Fe2+＞Cu2+＞Zn2+。在15℃、150 r/min及发酵48 h的条件下，该低温酶产率及酶活最高。提高产酶性能[7]，改善分泌方式是今后的研究方向。

[1]秦燕.β-半乳糖苷酶的应用研究进展[J].沈阳农业大学学报,2000,31(6):595-597

[2]陈卫,张灏,丁霄霖.一种高温乳糖酶的酶学性质及对牛乳中乳糖的水解[J].中国乳品工业,2002,30(6):15-18

[3]韩中.一株产β-半乳糖苷酶酵母菌株的选育研究[J].食品工业科技,2002(8):33-35

[4]郑铁曾,涂提坤,王建华,等.产β-半乳糖苷酶菌株的分离和筛选[J].微生物学通报，1981，8(1)：258-260

[5]蒋燕灵,丁倩,邵靖宇.耐热乳糖酶产生菌株的筛选及产酶条件试验[J].浙江大学学报：医学版,2001,3:110-114

[6]郭清泉,张兰威,林淑英.普通酸奶制品在贮存过程中发酵剂菌的β-半乳糖苷酶活性测定及变化规律研究[J].食品工业科技,2002,23(3):34-26

[7]陆淳,檀志芬,邱泉若,等.乳糖酶及其在乳品工业中的应用[J].中国乳品工业,2005,33(8):41-42

Low-temperature β-galactosidase Strain Screening

MA Hong-wei1，WANG Cong2，HU Li-xin2,*
（1.Inner Mongolia Mengniu Allah Dairy Co.,Ltd.,Beijing 101107，China;2.School of Chemical and Environmental Engineering,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,Hubei,China）

From the Inner Mongolia bogd shan mountain permafrost,as well as dairy products were isolated 25 cold-resistant bacteria,the use of low-temperature β-galactosidase model of screening,access to one lowproducing strains of C.With lactose as the main carbon source in the fermentation medium,the optimum pH value of low-temperature enzyme was 6.4,the optimum reaction temperature was 32℃,different metal ions on the activity of enzyme impact:Mn2+＞Mg2+＞K+＞Na+＞Ca2+＞Fe2+＞Cu2+＞Zn2+.4 ℃ relative activity of the total activity of 30%.

dairy products；psychrophilic bacteria;low-temperature β-galactosidase;enzymatic properties

马宏伟(1973—)，男（汉），硕士，研究方向：食品加工工艺。

*通讯作者：胡立新，1966，男，副教授。

2010-01-25