结缔组织生长因子与肝纤维化的研究进展

肖绪华综述,赵永忠审校

(桂林医学院附属医院消化内科,广西桂林541001)

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是近年来新发现的一种间质细胞的生长因子,具有明显的丝裂原性和趋化性,可以启动一系列介导组织创伤修复和再生的生物学过程。作为转化生长因子(transforming growth factorβ1,TGF-β1)的下游反应元件,CTGF 介导 TGF-β 1 促组织纤维化的效应,而与TGF-β1抗炎、调节免疫等其他生物学效应无明显相关,因此可能成为抗肝纤维化的更具特异性的靶点,在探索抗纤维化的道路上愈来愈引起大家的关注。本文就CTGF与肝纤维化的研究进展综述如下。

1 CTGF概述

CTGF最早是在人脐静脉内皮细胞的条件培养基中发现的,它属于一种即刻早期基因(CTGF Cyr61 Nov,CCN)家族成员之一。现已证明 CTGF基因位于第 6号染色体长臂(6q 23.1),相对分子量为 36 000～38 000,含 349个氨基酸残基,是一种C端富含半胱氨酸肝素结合蛋白的分泌性多肽,广泛表达于人类心脏、胎盘、肺、肝脏及肾脏等多种组织器官中。大量研究表明,CTGF可由多种类型的细胞产生,如胚胎组织、皮肤、肾小球系膜细胞、肾间质细胞、肝及胰腺星状细胞、血管内皮及平滑肌细胞,表达量取决于组织细胞类型及功能状态。事实上,CTGF是TGF-β生物学作用的下游效应介质,它在功能上与TGF-β具有很大的相似性,包括具有有丝分裂原效应,促使细胞增殖;促进细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成,抑制其降解,导致ECM的积聚及结构改建;表达细胞黏附因子使细胞易黏附和结合基质蛋白;具有趋化效应,在体外能趋化成纤维样细胞,而这些效应都与纤维化密切相关。相对TGF-β,CTGF的最大特点就是生物学功能比较单一,主要表现在对纤维化的影响[1]。另外,在对 TGF-β应答时CTGF可以调控关键的细胞事件,包括迁移、增殖、基质产生和成纤维细胞收缩、分化成肌成纤维细胞,这些都是纤维化应答事件[2]。说明CTGF是重要的促组织纤维化蛋白,在组织纤维化的形成和发展中起着关键的作用。

2 CTGF在肝纤维化组织中的表达和作用

CTGF在正常肝组织中的表达很少,仅在间质和肝血管有少量的表达[3]。但在肝纤维化动物模型肝组织及慢性肝病患者肝组织中CTGF mRNA和蛋白质表达水平增高,并与肝纤维化程度成正相关。Li等[4]运用蛋白质印迹技术和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法发现,四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化模型组与对照组相比,CTGF蛋白和基因表达明显增强。Hsu等[5]采用二甲基亚硝胺(DMA)诱导的大鼠肝纤维化模型,结果发现在给予DMA 2～5周后大鼠肝组织中TGF-β1和CTGF mRNA高表达,表达水平随着肝纤维化程度积分的增加而逐渐升高。Abou-Shady等[6]用Northern印迹杂交(Northern blot)分析显示,慢性病毒性肝炎、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、原因不明的肝病和酒精性肝病等患者的硬化肝脏中CTGF和TGF-β1 mRNA的表达水平与正常人肝脏相比增加了6～8倍。Horac等[7]研究发现在伴有肝脏脂肪变和纤维化的慢性丙型肝炎患者组织中CTGF的表达明显增强,并认为CTGF是独立的致肝纤维化因子。Kobayashi等[8]对胆管闭锁患者手术切除活检标本进行了原位杂交检测发现,在胆管闭锁患者肝组织中CTGF mRNA表达增高,特别是在肝细胞和星状肝细胞(HSC)中表达明显,而且表达与病变程度相关。可见在慢性肝病患者及肝纤维化动物模型肝组织中,CTGF mRNA和蛋白质表达水平增高,程度与肝纤维化积分成正相关,但与肝纤维化的类型无关。

研究表明,在肝组织中CTGF的主要来源于HSC。Paradis等[9]检测了原代培养 3 d(静止状态)、5 d(中间状态)和 7 d(活化状态)HSC的CTGF mRNA水平,结果发现其表达随时间进行性上调,同时Ⅰ型胶原mRNA的表达在第3天和第5天上调了近12倍,而且Ⅰ型胶原mRNA的表达增长相对滞后。结果证明HSC不仅能分泌CTGF而且提示CTGF可能对胶原基因表达具有调控作用。Gressner等[10]在培养的HSC和肝细胞两种细胞系分别测定CTGF和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,结果发现α-SM A在激活HSC中表达升高,而CTGF表达不依赖于细胞激活转化;并同时发现在被激活的肝细胞中CTGF强烈表达,说明肝细胞也可能参与了CTGF表达。在体内实验中,Tong等[11]通过将人CTGF基因转到大鼠体内,使其表达CTGF基因和蛋白,通过与非转基因大鼠比较发现,单纯的CTGF高表达并不能导致肝功能和肝组织学变化。但在给予CCl4以后,转基因大鼠无论是血清透明质酸水平还是肝组织中α-SM A、基质金属蛋白酶-2(MM P-2)和金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的mRNA表达水平较对照组明显升高。转基因大鼠在胆总管结扎2周后也表现出了大量的胶原蛋白沉积。说明体内CTGF水平升高不会导致肝损伤或纤维化本身,而是呈现出肝脏更容易受其他致纤维化因素所伤害。这可能是由于CTGF与其他分子如 TGF-β1、纤维连接蛋白相互影响,对这些因子信号传导起协同和放大的作用,CTGF的高表达改变了肝组织的微环境,增加了肝脏对损伤刺激的敏感性。这支持了CTGF在肝纤维化形成过程中的核心作用。

总之,激活的HSC可产生CTGF,而CTGF又可促进成纤维细胞的增殖、迁移、黏附和ECM的产生,诱导纤维化的产生[12]。CTGF还可能是多种纤维化信号通路下游的共同效应因子,在肝纤维化的发生、发展过程中起着关键作用,因此被称为肝脏疾病中扳动纤维化产生的“总开关”[13]。

3 CTGF与肝纤维化的诊断

肝纤维化主要靠肝组织穿刺活检诊断,但由于这是一种侵入性检查而且费用高,因而限制了其广泛使用,寻找一种良好的肝纤维化血清学指标具有很大的实用价值。大量研究表明CTGF在正常肝组织中仅有少量表达,在肝纤维化时CTGF表达升高且与肝纤维化程度相关。因由体内细胞产生的CTGF可以直接分泌到细胞外间隙,并进入体循环,因此使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血液中CTGF浓度被认为是一种诊断和评估纤维化程度的一个良好指标[14]。Kovalenko等[15]对138例丙型病毒性肝炎患者和129例慢性肝病患者血清CTGF水平进行了检测,结果发现丙型病毒性肝炎患者和慢性肝病患者血清CTGF水平较正常人明显增高,而且CTGF水平与肝纤维化程度和肝硬化分级有关;且同时发现CTGF存在多种基因型。Gressner等[16]采用多层免疫分析法检测了83例慢性肝病患者(包括17例慢性肝炎患者,16例组织学诊断为肝纤维化患者,50例肝硬化患者)和74例健康人的血清CTGF浓度。结果发现,慢性肝炎组、肝纤维化组和肝硬化组的血清CTGF浓度分别是健康对照组的4.3倍、5.2倍和3.2倍,说明了CTGF与肝纤维化有关;并发现硬化组的CTGF水平较纤维化组低,认为CTGF浓度反映的是纤维化发展的程度,并非组织硬化程度,因此可作为进展期肝纤维化程度的指标。Zhang等[17]也做了类似的研究,而且对患者的肝纤维化程度进行了详细的分级,用ELISA检测血清CTGF浓度。结果发现,健康人和慢性肝炎患者间、不同级别肝纤维化患者之间,CTGF浓度逐渐升高;说明CTGF的浓度不仅与肝纤维化相关而且随着肝纤维化程度的加重而升高,提示CTGF可能是诊断和反映肝纤维化程度的良好标志物。

4 干扰CTGF表达与肝纤维化的基因治疗

CTGF作为 TGF-β的下游介质,是一个比 TGF-β更具特异性的靶位。因此,针对CTGF的治疗策略受到广泛的关注。多项研究表明,针对CTGF转录水平的干扰可能是一种有效的抗肝纤维化的治疗方法。Zhu等[18]将能在体内自主合成短发夹状RNA(shRNA)的pEGFP-CTGF表达质粒转入HSCT6(一种鼠源性激活的HSC株),观察其对CTGF mRNA及蛋白表达的影响。结果发现,转染 pEGFP-CTGF shRNA1的HSC-T6细胞CTGF的表达被干扰,显著减少Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层黏蛋白(LN)和透明质酸(HA)的形成。Li等[19]在HSC培养基中加入抗CTGF的小分子干扰RNA(siRNA),发现在HSC培养基中抗CTGF的 siRNA高效特异的抑制了CTGF的基因表达,同时发现α-SMA表达显著降低。在激活的HSC中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA的表达及上清液中HA浓度均降低。说明siRNA能有效和特异性下调大鼠HSC的CTGF的表达,显著抑制HSC的活化和增殖并能有效抑制细胞外基质生产,应用siRNA抑制CTGF基因表达可能是抗肝纤维化治疗的一种有效的策略。同时发现在加入siRNA大鼠原代HSC培养7 d(激活期)后,观察到HSC G0/G1时相细胞比例明显增多,表明siRNA沉默CTGF可能是通过诱导细胞周期静止来抑制大鼠HSC增殖。诱导细胞周期静止可能是siRNA沉默CTGF抑制大鼠HSC增殖的机制之一。

在体内实验中,Uchio等[20]用CCl4诱导小鼠肝纤维化的发生,以反义核苷酸对HSC的CTGF进行RNA干扰,可减少CTGF、TGF-β和Ⅰ型胶原mRNA的表达,而 TIM P-1和纤维沉积的量没有改变。说明单纯降低CTGF的水平虽可抑制肝纤维化的发生发展,但由于TIMP-1的持续高表达,干扰CTGF表达抗纤维化治疗的效果受到影响。Li等[4]应用门静脉注射CTGF siRNA的方法对CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型进行治疗,结果发现siRNA治疗组Ⅰ、Ⅲ型胶原,LN、TIMP-1和TGF-β1的基因表达均减弱,活化的 HSC数量减少,α-SMA表达降低 ,血清中Ⅲ型前胶原、肝羟脯氨酸与肝纤维化程度均降低。George和Tsutsumi[21]发现在二甲基亚硝胺(DMA)所致的肝纤维化模型中,应用CTGF siRNA治疗后CTGF以及TGF-β1基因表达减弱,HSC的活化受抑制,肝脏中结缔组织沉积减少。结果表明CTGF siRNA可以有效的预防和治疗DMA所致的大鼠肝纤维化。

总之,沉默或干扰CTGF基因表达的方法在体内外实验中均表现出强烈而且特异的抑制ECM沉积的作用,抗CTGF的基因治疗做为一种崭新的抗纤维化手段,给抗纤维化治疗带来了新的思路,具有广阔的应用前景。

5 展 望

CTGF是调控器官纤维化的重要细胞因子,不仅直接调节HSC的活化和ECM的产生,而且可能是纤维化信号通路下游的共同效应因子,在多种组织器官纤维化中起关键作用。另外,CTGF生物学作用比其上游控件TGF-β1更单一,主要局限在纤维化的发生方面。抑制CTGF表达的治疗比抗TGF-β1更具针对性,而不影响 TGF-β1的抗炎、免疫抑制等重要生理作用。进一步深入研究CTGF的基因表达调控、信号传导通路及致纤维化机制,将有助于探索更特异更有效的抗纤维化治疗策略,为控制纤维化疾病带来崭新希望,具有重要的临床意义。

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