肾活检标本的冰冻切片直接免疫荧光法中冰冻切片对包埋剂的选择及应用

林宇静 王晓鸿 苟新敏 郑燕璇 曹婉维

肾脏疾病中，变态反应在其病因发病机制中占很大比重，所以在肾活检标本中显示抗原或抗体是很重要的，一般使用冰冻切片直接免疫荧光法观察切片标本上荧光抗体染色结果作为抗原的鉴定和定位。冰冻切片直接免疫荧光法要求冰冻切片质量优良，制作一张质量优良的冰冻切片，制片过程中的每一步环节都很重要，其中包埋剂的使用也很关键，包埋剂包埋组织(-20℃ ～25℃)冷冻后对组织起到支托固定的作用。现工作中制作冰冻切片常用包埋剂是OCT，在多年临床工作中，我科使用普通胶水替代OCT包埋，所制冰冻切片用于直接免疫荧光检查与使用OCT包埋剂所制冰冻切片用于直接免疫荧光检查效果相同。

1 材料与方法

1.1 材料 肾活检标本，普通胶水(把胶水装入用完的OCT包埋剂的空瓶中)，冰冻托盘架置于(-20℃ ～25℃)冰冻切片机箱体中待用，载玻片、荧光抗体(兔抗人IgA、兔抗人IgG、兔抗人IgM、兔抗人C1q、兔抗人C3)抗体为丹麦DAKO公司产品，PBS，缓冲甘油等。

1.2 方法 将肾活检组织取材后放置到待用的托盘架正中位置上(由于肾活检组织小，托盘架要做底座，用胶水替代OCT做底座)，用胶水替代OCT将组织块完全包埋。在-20℃～25℃温度中托盘架上的组织被包埋剂包裹迅速凝冻固定。取下托盘架固定到冰冻机的冷冻头上。(冷冻头设定温度为-15℃左右)开始修切冷冻头上的组织至合适时留片，切片要求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜检。取出切片用吹风机冷风吹干固定。PBS冲洗3次，3 min/次，甩去PBS加荧光抗体20 μl，置于37℃温箱孵育18～30 min取出，PBS冲洗3次，3 min/次，甩去PBS，缓冲甘油封片避光。

2 结果

用胶水包埋的组织块凝冻迅速，质感均匀、易切出完整的组织片、易展片，留片后胶水在玻片上容易用水洗净，同时组织不易脱落。制成免疫荧光片后用荧光显微镜检查(最好在染色当天即作镜检，以防荧光消退，影响结果)，免疫荧光着色不受影响，背景染色、阳性强度及阳性检出率，与用OCT包埋剂包埋的冰冻切片制成的免疫荧光片相比较效果无异。(见图1、图2)

图1 胶水包埋冰冻切片，直接免疫荧光检查

图2 OCT包埋冰冻切片，直接免疫荧光检查

3 讨论

肾活检标本的免疫荧光检查对肾脏疾病病理诊断起重要的辅助作用，而免疫荧光检查中标本的抗原的鉴定和定位直接影响肾脏疾病病理诊断。因此标本制作的好坏直接影响到检测的结果。在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和封埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至邻近细胞或组织间隙中去。冰冻切片的原理是用物理方法低温冰冻被包埋剂包埋的组织块后再切片制片，包埋剂本身与组织不会有任何化学反应，包埋剂不会破坏抗原的完整性，不会引起抗原发生溶解和变性。用包埋剂将组织块包埋，在低温下迅速凝冻后能对组织块起支托固定的作用，达到容易切片的目的。质量好的包埋剂(OCT)凝冻时间短，切片时质感滑脆均匀，易切片、展片，易用清水洗去。质量差的包埋剂(OCT)，包埋组织块时凝冻时间长，切片时包埋剂发硬，不易切片、展片、不易用清水洗去，易使组织脱落。通过反复实验和临床应用后，认为普通胶水代替OCT包埋来制作冰冻切片用于直接免疫荧光检查效果完全与用OCT包埋剂所制切片无异(质量好的包埋剂)。普通胶水价格便宜，容易购买，进口OCT价格昂贵，同规格相比，后者价格是前者的上百倍。用胶水代替OCT包埋肾活检组织来制作冰冻切片用于直接免疫荧光检查，大大降低了成本，本方法值得推广。