钝化NF-κB的活化对酒精性肝损伤大鼠CYP3A的影响

康晓琳，薛永志，许秀举，刘和莉

长期过量饮酒导致的酒精及其代谢产物对肝脏的毒性作用、氧化应激、脂质过氧化、细胞因子和免疫反应等多种因素有关的肝细胞损伤，已经成为继病毒性肝炎后导致肝损害的第二大病因［1］。CYP3A是CYP450氧化代谢酶超家族中含量最多的亚型，参与该酶系中50%以上外源性药物、毒物或致癌物等氧化代谢［2－3］，但在酒精性肝损伤过程中是否参与其中，不同实验室得出截然不同的结果，并且其确切机制尚未明确［4－5］。NF-κB 在炎症及免疫反应中被高度诱导，并且对氧化应激敏感，在肝脏炎症、纤维化及肝细胞再生、脂质过氧化等病理生理过程中起着重要作用［6－7］。Wahl等［8］发现柳氮磺胺吡啶(salazosulfapyridine，SASP)可以通过抑制 IκB的磷酸化从而发挥抑制NF-κB的作用，因此可以阻止NF-κB向核内移位，减少下游细胞因子的表达。本研究以白酒灌胃法制备大鼠酒精性肝损伤模型［9］，观察 CYP3A 的代谢活性、NF-κB 蛋白表达有何变化，采用SASP抑制NF-κB，观察对CYP3A氧化代谢活力和肝功能的影响，深入探讨NF-κB在酒精性肝损伤中的作用及其作用环节，为酒精性肝脏疾病药物治疗提供新的靶点和思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 清洁级♂Wistar大鼠48只，体质量(200±20)g，动物许可证号:SCXK(蒙)2002－0001，购自内蒙古大学实验动物中心。柳氮磺胺吡啶(salazosulfapyridine，SASP)，上海信谊嘉华药业有限公司，批号:H31020557;56度红星二锅头由北京红星股份有限公司生产;咪哒唑仑(midazolam，MDZ)注射剂，徐州恩华集团药业有限责任公司生产，10 mg/2 ml/支，批号:20080604;兔抗大鼠NF-κB p65多克隆抗体，即用型SABC免疫组化试剂盒，DAB显色剂均购于武汉博士德生物工程有限公司;其它药品均为分析纯。

1.2 主要仪器 高效液相色谱仪，Thermo Finnigon公司生产;RH-200智能热板仪，成都泰盟科技有限公司生产;sartorius分析天平，北京塞多利斯仪器有限公司;CX41RF奥林帕斯显微镜;形态分析系统，江苏省捷达科技发展有限公司。

1.3 动物分组及建模方法 Wistar大鼠48只，经1周的喂养适应后，随机分为3组，第1组(Control，n=16)经灌胃给予NS 2 ml/次，1天2次，至20 d;第2组(Ethanol，n=16)给予56度红星二锅头，10 mg·kg－1，1天 2次灌胃，至 20 d;第 3组(Ethanol+SASP，n=16)将 SASP(0.75 mg·kg－1)溶于白酒(10 mg·kg－1)中，1 天2 次灌胃，至20 d 末，于当晚禁食，d 21先将所有大鼠称重，再将3组大鼠每组中的8只经腹腔注射给予CYP3A探针MDZ(10 mg·kg－1)，并于给药后15、30、45、60、120 min 各时间点经眼内眦静脉丛采血0.5ml，置肝素化试管中，3 500 r·min－110 min，分离血浆，置 －20℃冰箱冷冻，按文献［10］采用HPLC法进行咪哒唑仑血药浓度经时变化的测定。再断尾取血4 ml，3 500 r·min－1离心10 min，抽取血清2 ml，置 －20℃冰箱冷冻，待测血清中ALT、AST水平。另外每组其余8只大鼠经腹腔注射给予CYP3A的探针药物MDZ(0.5 mg·kg－1)，并于给药40 min后，将大鼠置于50℃热板上，同时计时，记录大鼠第1次舔后足的时间，作为反应时间，并记录大鼠5 min内舔后足的次数。随后将大鼠颈椎脱臼处死，迅速剖取肝脏，称重，将肝组织浸泡于事先配好的甲醛酒精(甲醛 ∶酒精=1∶9)固定液中，做石蜡包埋切片，常规HE染色及免疫组织化学测定。

1.4 肝组织NF-κB免疫组化染色 肝组织石蜡切片NF-κB免疫组化染色方法按试剂盒说明书进行，一抗稀释倍数为1∶100。每张切片选择染色良好区域，随机观察10个高倍视野。NF-κBp65以细胞染成棕黄色为阳性，采用形态分析系统统计每个视野中阳性细胞数、灰度、平均吸光度(average absorbance，AA)和积分吸光度 (integrated absorbance，IA)。细胞阳性率以每高倍镜下阳性细胞数(细胞数/高倍镜视野)来表示。

2 结果

2.1 各组大鼠的一般状态及肝脏病理学、生化指标的改变 经过20 d酒精刺激，Ethanol组大鼠表现为体重增加量明显减少(P＜0.01)，肝重系数增大(P＜0.01);而Ethanol+SASP组大鼠体重增加量是Ethanol组的1.2倍，肝重系数大于Control组，小于比Ethanol组。光镜下可见，Ethanol组肝小叶界限不清，肝细胞出现空泡变性，同时散在淋巴细胞及单核细胞。Ethanol+SASP组肝小叶结构清晰，但肝窦轻度狭窄。肝细胞内无明显空泡及疏松，部分肝细胞呈轻度浊肿。Ethanol组大鼠血清AST、ALT均较对照组升高，以ALT升高为明显。Ethanol+SASP组血清ALT和AST较Ethanol组有所降低(Tab 1)。

Tab 1 Rat body weight gain，liver weight/body weight，serum ALT and AST levels in all groups(±s，n=8)

Tab 1 Rat body weight gain，liver weight/body weight，serum ALT and AST levels in all groups(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs ethanol

Group Total body weight gain/g Liver/%of body weight ALT/U·L－1 AST/U·L －1 Control 62.50 ±22.31 3.78 ±0.24 74.67 ±7.83 104.67 ±13.83 Ethanol 29.17±13.20＊＊ 5.35±0.60＊＊ 87.17±12.40＊＊125.66 ±15.88*Ethanol+SASP 35.00 ±1.41 4.88 ±0.61* 77.00 ±4.38#109.50 ±12.95

Fig 1 Pathological features in liver(HE×400)A:Control group;B:Ethanol group;C:Ethanol+SASP group

2.2 各组大鼠CYP3A代谢活力的变化 3组大鼠经腹腔给予经CYP3A代谢的探针药物咪哒唑仑(10 mg·kg－1)，经HPLC测得大鼠血浆中咪哒唑仑血药浓度的经时变化如Tab 2、3所示，Ethanol组在给药后各时间点血浆中咪哒唑仑血药浓度均明显低于Control组(P ＜0.01)，、AUC 、Cmax均减小(P ＜0.01)，Ethanol+SASP 组抑制 NF-κB 后，血浆中咪哒唑仑血药浓度明显高于Ethanol组(P＜0.05)，AUC、Cmax明显增大(P＜0.01)。从Tab 4可以看出Ethanol组与Control组相比，在给予咪哒唑仑40 min后，大鼠的反应时间明显缩短(P＜0.01)，5 min内舔足次数也明显增多(P＜0.01)，而Ethanol+SASP组大鼠反应时间与Ethanol组相比有明显延长(P＜0.05)，而舔足次数明显减少(P＜0.01)。

2.3 各组大鼠NF-κB变化 光镜下，大鼠肝组织NF-κBp65的阳性细胞呈明显的棕黄色或深棕色，分布于细胞质和细胞核，表达强度不一，以中央静脉周围表达多(Fig 2)。与Control组相比，Ethanol组肝细胞的NF-κBp65细胞阳性率明显增高(P＜0.01)，灰度明显降低(P＜0.01)，AA降低(P＜0.01)，IA增高(P＜0.01)。而Ethanol+SASP组与Ethanol组相比大鼠肝组织中的NF-κBp65细胞阳性率降低(P＜0.01)，灰度明显回升(P＜0.01)，IA值明显减小(P＜0.01)，而AA值差异未见显著性，见Tab 5。

3 讨论

白酒灌胃20 d成功复制了大鼠急性酒精性肝损伤模型，表现为大鼠肝重增加，功能受损，肝细胞出现轻度脂肪样变。白酒灌胃法与酒精灌胃法相比更与人类的酒精性肝损伤接近，并有大量文献支持［11］。目前，关于酒精性肝损伤过程中CYP3A代谢活力是否增强不同实验室得出不同的结果，有报道［4］，中度酒精性肝损伤CYP3A活力无变化，但是减少咪哒唑仑口服生物利用度，可能是肠内CYP3A诱导的结果。还有报道［5］，中度酒精性肝损伤与CYP3A活力密切相关，明显增加其代谢活力，但CYP3A上调机制尚未明确，可能与核受体转录因子的调节有关。研究认为［12］，当血液和肝组织乙醇浓度较低时，大部分乙醇由乙醇脱氢酶氧化代谢，但大量饮酒而使肝组织乙醇浓度超过0.01 mol·L－1时，细胞色素P450混合功能氧化酶系统被激活。本研究结果表明，酒精损伤可导致CYP3A代谢能力增强，肝脏NF-κB的蛋白表达明显增加。本研究结果与文献［5，11］报道一致。

Tab 2 Plasma MDZ levels in all groups( ± s，n=8)

Tab 2 Plasma MDZ levels in all groups( ± s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs ethanol

Time/min 15 30 45 60 120 Control/mg·L －1 4.14 ±0.70 2.58 ±0.46 1.49 ±0.11 1.17 ±0.17 0.39 ±0.15 Ethanol/mg·L－1 1.92 ±0.19＊＊ 0.68 ±0.13＊＊ 0.39 ±0.23＊＊ 0.25 ±0.07＊＊ 0.01 ±0.02＊＊Ethanol+SASP/mg·L－1 2.91 ±0.18# 1.54 ±0.41# 0.78 ±0.16# 0.47 ±0.11# 0.19 ±0.09#

Tab 3 Plasma MDZ pharmacokinetic Levels in all groups(±s，n=8)

Tab 3 Plasma MDZ pharmacokinetic Levels in all groups(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs ethanol

T 1/min AUCCmax Group Ke 2/mg·min·L －1/mg·L －1 Control 0.010 ±0.003 75.006 ±17.507 238.160 ±29.253 4.144 ±0.701 Ethanol 0.021 ±0.005＊＊34.380±8.673*101.186±9.411＊＊1.918±0.190＊＊Ethanol+SASP 0.013 ±0.005 58.925 ±16.866 162.614 ±13.342##2.911 ±0.181##

Tab 4Sedation of MDZ in all groups(±s，n=8)

Tab 4Sedation of MDZ in all groups(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs ethanol

Duration of licking/s Licking times/times Control 37.87 ±7.42 31.67 ±7.66 Ethanol 26.31 ±7.67＊＊ 59.00 ±9.08＊＊Ethanol+SASP 35.75 ±6.74# 43.54 ±7.87##

Fig 2 Immunohistochemistry of NF-κB p65 expression in rat liver(SP×400)A:Control group;B:Ethanol group;C:Ethanol+SASP group

Tab 5 Number of NF-κB p65 positive cells/high-power field in all groups(±s，n=4)

Tab 5 Number of NF-κB p65 positive cells/high-power field in all groups(±s，n=4)

＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs ethanol

Number of positive cells/high power field/% Gray Average absorbance(AA)Integrated absorbance(IA)Control 9.21 ±3.96 207.77 ±5.37 0.24 ±0.01 2.82 ±0.15 Ethanol 33.49±12.12＊＊401.61±44.78＊＊ 0.36±0.04＊＊ 31.60 ±12.41＊＊Ethanol+SASP 19.37±8.08## 301.93±29.16## 0.23±0.03 3.91 ±1.92##

应用SASP钝化NF-κB的活化，大鼠肝脏NF-κB的蛋白表达减少，CYP3A的代谢活力下调，同时肝脏脂肪变性程度减轻，且血清AST、ALT含量明显下降。酒精肝损伤后，能使肠粘膜屏障受损，肠道通透性增加，并且肝脏巨噬细胞的吞噬能力下降，致使机体内毒素如脂多糖(LPS)等的水平上升，导致内毒素血症。内毒素可以通过结合枯否细胞上CD14受体来激活NF-κB，活性氧(ROS)可能是所有刺激物激活NF-κB共同机制和LPS诱导细胞信号系统的核心，ROS增殖能减少巯基来增加细胞被氧化比例，调节NF-κB激活，NF-κB可以增加氧化信号通路的敏感性，导致基因产物的增多［13－14］。抑制NF-κB的活化对酒精性肝损伤具有一定保护作用，一方面是由于在NF-κB的活化受到抑制后，其调控的下游炎性细胞因子转录减少，从而减轻肝脏的炎症损伤;另一方面，抑制NF-κB可以扭转CYP3A代谢活力的上调，减少活性氧族的产生，减少肝细胞的脂质过氧化，同时减少了ROS作为第二信使对NF-κB的活化，形成一种良性循环。有关酒精性肝损伤过程中CYP3A代谢活力的调控是否经由NF-κB转录调控，可否通过转录调控代谢酶活力干预损伤过程有待进一步深入研究。

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