壳聚糖对异育银鲫非特异性免疫功能的影响

曹志华，严书林， 罗静波，余文斌

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

壳聚糖对异育银鲫非特异性免疫功能的影响

曹志华，严书林， 罗静波，余文斌

(长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

为了解壳聚糖对鱼类非特异性免疫机能的影响，以体重20.5～24.8 g的异育银鲫为研究对象,在其饲料中分别添加0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/100 g的壳聚糖,在23～25 ℃水温下饲喂30 d后,分别测定各组鱼的血清、脾脏、头肾的溶菌酶活性和白细胞吞噬活性，以及肌肉、肝胰脏和血清的SOD活性。结果显示，饲料中添加0.5～2 g/100 g的壳聚糖能显著提高异育银鲫的溶菌酶活性(Plt;0.05)和白细胞吞噬活性(Plt;0.05),而对SOD活性没有明显影响。

异育银鲫；壳聚糖；非特异性免疫

抗生素在水产养殖的疾病预防和治疗中过度广泛的使用，导致其负面作用越来越突出，因此免疫刺激物的研究越来越受到人们的重视。免疫刺激物如细菌多糖类、化学物质及动植物提取物对鱼类白细胞吞噬能力及溶菌酶的活性有关，它们可以增强鱼类对多传染性病原的非特异性免疫反应，提高鱼类的整体抗病力[1～5]。目前，关于甲壳素和壳聚糖的研究虽有报道，但主要是研究昆虫壳聚糖对养殖鱼类的影响，且结果也并不一致，因为壳聚糖的来源不同、分子量不同，其对抗病的影响也不一样。

为了解壳聚糖对鱼类免疫功能的影响，本研究从虾壳中提取壳聚糖，以异育银鲫为研究对象，探讨了不同添加量的壳聚糖对异育银鲫的溶菌酶活力、白细胞吞噬活性及SOD活性的影响，以期为壳聚糖在水产饲料中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

受试异育银鲫来源于长江大学水产基地，体重为20.5～24.8 g，暂养1周后，挑选体色正常、体质健壮、健康无病的个体用于试验。

壳聚糖的制备参照文献[1～4]。具体方法为：将收集的新鲜虾壳,先去除虾壳内外表面的异物,然后经脱钙、脱色等工序制成甲壳素,其工艺流程为:蟹壳→水洗→碱浸→水洗→酸泡→脱色→水洗→干燥→粉碎→成品。再将甲壳素与氢氧化钠溶液在三口烧瓶中混合搅拌,在一定温度下回流一定时间后,过滤、洗涤、烘干，产物即为壳聚糖。经测定，其壳聚糖含量为40.33 g/100 g、蛋白质含量32.06 g/100 g 、粗脂肪含量0.99 g/100 g、 钙含量10.74 g/100 g。

1.2 试验方法

试验鱼共分6组(Ⅰ～Ⅵ)，分别饲养在55 cm×35 cm×45 cm的水箱中，每组3个平行，共18个水箱，每箱放30尾，分别饲喂对应组别饲料。各组试验饲料分别添加0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/100 g的壳聚糖，其配方详见表1。

饲养期间使水温控制在23～25 ℃，充气泵间歇增氧(每隔45 min增氧10 min)。按体重2%～3%每天投喂饲料2次。1 h后清除箱中的污物，并换掉箱中2/3的水，饲养30 d。

1.3 白细胞吞噬活性的测定

将金黄色葡萄球菌接种在液体肉汤培养基上，37 ℃下培养48 h，离心集菌，加入浓度为1%的福尔马林37 ℃灭活24 h，用灭菌生理盐水清洗并稀释至一定浓度，调整细菌浓度为1.0×108个/mL，保存于40 ℃冰箱中备用。在0.2 mL抗凝血中加入0.1 mL 1.0×108个/mL 的金黄色葡萄球菌液，摇匀后放在28 ℃恒温水浴锅中孵育1 h，2 000 r/min离心15 min，用吸管吸取红细胞与血浆交界的白细胞层制涂片干燥，甲醇固定3 min,姬姆萨染色2 h。每尾鱼的抗凝血制作5张涂片，每张涂片在油镜下计数100个白细胞，以下式计算吞噬百分比和吞噬指数

表1 各组饲料原料组成Table 1 Ingredients compositions of the experimental diets g/100 g

注：各组饲料原料粉碎后过60目筛,微量成分采取逐级扩大法添加与大原料混合均匀后,用螺杆制粒机挤压成型,风干后放入冰箱中冷冻备用。

吞噬百分比(PP，%)=(参与吞噬的白细胞数÷100个白细胞)×100

吞噬指数(PI)=100个白细胞内吞噬菌体总数/吞噬细菌的细胞数

1.4 溶菌酶活性的测定

以3尾鱼为1组，断尾采血，加至5 mL离心管中，静置，冰箱中保存24 h，血清析出备用。取完血的鱼用剪刀沿腹中线剪开，取出鱼的脾脏和头肾，分别加入pH 6.5、5倍体积的0.1 mol/L的磷酸缓冲溶液，在冰水中匀浆，以1 000 r/min匀浆10 min，取上清液备用。以溶壁微球菌(Micrococcuslysoleikticus)冻干粉为底物，用0.1 mol/L，pH 6.4的磷酸钾盐缓冲液配成底物悬液(光密度D570 nm≈0.3)。取3 mL该悬液于试管内置冰浴中，加入50 μL待测液混匀，测其光密度D0。然后将试液移入37 ℃ 温浴中30 min,取出后立即再置于冰浴中10 min以终止反应，测其光密度D。溶菌酶活性UL按下式计算：UL=(D0-D)/D

1.5 SOD活性的测定

异育银鲫的肌肉、肝胰脏和血清的SOD活性采用南京建成生物有限公司的试剂盒进行测定，其活性单位定义为：每毫升血清或每毫克组织在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个酶活力单位(U/mL)。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖对异育银鲫抗病力的影响

饲喂30 d后,壳聚糖对异育银鲫白细胞吞噬活性和溶菌酶活性有显著影响(表2)，与对照组相比，壳聚糖添加量在0.5～2.0 g/100 g的范围内，白细胞的吞噬百分比和吞噬指数都有显著差异(Plt;0.05)，血清溶菌酶和脾脏溶菌酶活性也有显著差异(Plt;0.05)，但头肾溶菌酶活性在添加0.5 g/100 g的壳聚糖组与对照组和2.5 g/100 g添加组没有显著差异(Pgt;0.05)。

表2 壳聚糖对异育银鲫抗病力相关因子的影响Table 2 Effect of chotisan on factors related to anti-disease of allogyogenetics silver crucian carp

注：同列数据后不同字母表明组间差异显著(Plt;0.05 )。

2.2 壳聚糖对异育银鲫SOD活性的影响

表3 壳聚糖对异育银鲫肌肉，肝胰腺及血清中SOD活性的影响Table 3 Effect of chotisan on SOD activity in muscle，hepatopancrea and serum of allogyogenetics silver crucian carp

饲料中添加壳聚糖对异育银鲫肌肉、肝胰脏和血清中SOD活性没有显著影响(表3)。不添加壳聚糖，组织中SOD活性依次为肝胰脏gt;血清gt;肌肉。添加壳聚糖后，虽然随着添加量的增加，SOD活性有下降的趋势，但各组之间没有明显差异(Pgt;0.05)。

3 讨论

动物体内的吞噬细胞在吞噬消化病原生物的同时，可以保留抗原信息，并将其传递给有关的淋巴细胞，从而激发机体的体液免疫和细胞免疫。溶菌酶是淋巴细胞分泌的碱性溶解酶，主要做用于革兰氏阳性菌及某些特定细菌的细胞壁的粘多糖，当机体遭到病原攻击时，白细胞的吞噬作用加强，也使溶菌酶的活性增加[5]。王树芹等[6]的试验结果表明，壳聚糖能提高白细胞的吞噬能力和溶菌酶的活性，但随着添加量的增加，会出现免疫疲劳现象。本研究结果也表明，添加适量的壳聚糖能提高白细胞的吞噬活性和溶菌酶的活性。虽然随着添加量的增加(0.5～2.0 g/100 g)，白细胞的吞噬活性和溶菌酶活性比较稳定但均明显高于对照组，但当添加量达到2.5 g/100 g时，白细胞的吞噬活性和溶菌酶的活性反而出现下降，所以在本研究认为壳聚糖的最适添加量应为0.5～2.0 g/100 g。这个范围与有些研究结果[6～8]不符，他们的研究认为壳聚糖的添加量为0.5 g/100 g效果最好。产生这样差异的原因可能与壳聚糖的来源不同有关，本研究使用的壳聚糖系从虾壳中提取，其纯度和和成分与之相比可能有所不同。

SOD是关键的抗氧化酶之一,它可以清除体内多余的自由基,使自由基的形成与消除处于一种动态平衡中,免除其对生物分子的损伤。有研究表明，SOD活性与生物的免疫水平呈密切相关[9]。因此，SOD可作为机体非特异性免疫指标,来评判免疫刺激剂对机体非特异性免疫力的影响。本研究结果表明，对照组各组织中SOD活性不同,其中以肝胰腺和血清含量较高，肌肉的相对较低。添加壳聚糖对SOD的活性没有产生明显影响，虽然随着壳聚糖添加量的增加，其活性有逐步下降的趋势，但差异并不显著。

[1]欧阳涟，谢 宇，洪小伟.化学法制备壳聚糖的研究[J].河南工业大学学报(自然科学版),2009，(6):656～658.

[2]陈东辉，陈 亮. 壳聚糖制备方法的比较研究[J]. 化学研究与应用,2002,14 (1):56～58.

[3]王 勇，张成钢，张 舟，等.高活性壳聚糖的制备及特性[J].微生物学杂志，2001，21(1)：27～28.

[4]张子涛,陈东辉. 甲壳素脱乙酰化及其动力学研究[J]. 青岛大学学报，2000,15(4):23～26.

[5]Marja M,Antti S.Changes in plasma lyaozyme and blood leucocyte leveal lf hatechery-reared Atlantic Salmon and sea trout(SalmotruttaL) during parr-smolt tramsformation[J].Aquaculture,1992,106:75～87.

[6]王树芹，周洪琪.壳聚糖对异育银鲫溶菌酶和白细胞吞噬活性的影响[J]. 上海水产大学学报，2004，13(2):121～125.

[7]陈 勇，周洪琪，冷向军，等. 壳聚糖对异育银鲫生长和消化酶的影响[J].中国水产科学，2006，13(3)：440～443.

[8]翟少伟，王 敦，黄沧海.昆虫壳聚糖对鲫鱼生长及肠道消化酶活性的影响[J].云南农业大学学报，2009，24(4)：566～569.

[9]丁美丽,林 林,李光友,等.有机污染对中国对虾体内外环境影响的研究[J].海洋与湖沼,1997，28(1):7～12.

2010-05-25

曹志华(1966-)，女，湖北监利人，农学硕士，副教授,主要从事动物营养研究..

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.011

S942.1

A

1673-1409(2010)02-S029-03