胞内聚-β-羟基丁酸酯对苏云金芽胞杆菌营养细胞耐受性的影响

胞内聚-β-羟基丁酸酯对苏云金芽胞杆菌营养细胞耐受性的影响

以苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)BMB171及其聚-β-羟基丁酸酯(Poly-3-hydroxybutyrate，PHB)合成基因簇(phaRBC)强化菌株BMB171+p和PHB合成酶基因(phaC)阻断突变株BMB171-p为研究对象，系统比较BMB171及其PHB基因强化和阻断菌株之间对逆环境耐受能力(包括耐热、抗冻、抗紫外和耐饥饿)的差别。结果表明：胞内PHB能增强苏云金芽胞杆菌菌体对逆环境的耐受能力。

聚-β-羟基丁酸酯；苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)；逆境生理；耐受性

聚-β-羟基丁酸酯(Poly-3-hydroxybutyrate，PHB)是微生物细胞在其生长的特定时期在胞内合成具有相应功能的聚羟基烷酸酯，它可作为菌体内的一种储备性碳源[1]。此外，还发现细菌胞内 PHB在菌株对逆环境的耐受性中扮演着重要角色。Lopez等[2]对巨大芽胞杆菌(Bacillusmegatroium)和其PHB合成缺陷型突变株在土壤中生存能力进行对比实验，发现积累PHB对巨大芽胞杆菌在自然环境中生存是一种优势。戴美学等[1]发现苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)PHB合成缺陷型表现出生长竞争能力的严重缺陷和竞争结瘤能力的大幅度下降。另外通过调节培养条件比较Pseudomonassp.在产PHB和不产PHB 2种情况下菌株耐热以及抗氧化的能力，结果表明能够产生PHB的菌株对逆环境具有更强的抗性[3]。

苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一种昆虫致病菌，对鳞翅目、鞘翅目等农林业害虫及蚊虫等卫生害虫具有杀虫活性，是应用最为广泛的微生物杀虫资源。Bt在生长阶段，能够积累聚-β-羟基丁酸(PHB)，可作为合成芽胞和杀虫晶体蛋白的能源储藏物质[3]。为探讨苏云金芽孢杆菌胞内的PHB是否也扮演细胞抗逆角色，本研究以无质粒突变株BMB171及其PHB合成基因簇(phaRBC)强化菌株 BMB171+p和PHB合成酶基因(phaC)阻断突变株 BMB171-p为对象，考察对数期末期营养体细胞对逆环境条件处理(包括热处理、冷处理、紫外辐照以及饥饿处理)的存活能力。

国内外对于苏云金芽胞杆菌中PHB的生理功能还未有具体报道。通过研究苏云金芽胞杆菌中PHB对菌体生理的影响，揭示了PHB在苏云金芽胞杆菌中所扮演的生物学功能，为进一步深入研究苏云金芽胞杆菌中PHB的代谢奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171(B.thuringiensissubsp.kurstakiBMB171 )；苏云金芽胞杆菌工程菌株BMB171+p， 来源于BMB171， 通过转入带有PHB合成基因簇(phaRBC)的质粒载体pHT304， 构建成PHB高产突变株；苏云金芽胞杆菌工程菌株BMB171-p，来源于BMB171，通过与带有PHB合成基因部分同源片段的质粒pEG491 进行同源重组， 阻断PHB合成酶基因phaC， 得到PHB合成缺失突变株。所有菌株均由笔者所在实验室构建并保存。

1.2 培养基

(1)斜面培养基 LB固体培养基：蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，酵母浸粉 5 g，琼脂 20 g，蒸馏水1 000 mL；初始pH 7.2～7.5，120 ℃，15 min灭菌。

(2)种子培养基 LB 液体培养基：蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，酵母浸粉 5 g，蒸馏水1 000 mL；初始pH 7.2～7.5,15 min灭菌。

(3)发酵培养基 PM培养基：蛋白胨10 g， 葡萄糖5 g， 酵母抽提物2 g，KH2PO41.0 g， MgSO4·7H2O 0.3 g， FeSO4·7H2O 0.02 g，ZnSO4·7H2O 0.02 g，MnSO4·H2O 0.02 g，初始pH 7.2～7.5，115 ℃，20 min灭菌待用。

1.3 方法

(1)菌液制备 将斜面菌种转接到种子培养基中，培养7 h(30 ℃， 200 r/min )，然后取0.2 mL接入20 mL 发酵培养基中， 培养10 h(30 ℃，200 r/min)后，5 000 r/min离心10 min收集菌体，用磷酸缓冲液(pH 6.8 )洗涤2次后加无菌水恢复至原来体积，放置备用。

(2)耐热试验 吸取0.5 mL 菌液加入到已预热好的装有4.5 mL无菌水的试管中，分别用45 ℃、50 ℃ 、55 ℃和60 ℃ 4种温度水浴恒温加热，稀释平板计数，测定杀死90%的菌体所需要的时间。

(3)低温耐受试验 将菌体在发酵培养基中培养至稳定期初期，分装至1.5 mL 离心管中，放置-20 ℃低温冰柜中，5 d后稀释平板计数，计算存活率。

(4)抗紫外试验 将菌液稀释100倍，取30 mL放入平板中，于距离40 W紫外灯55 cm处分别照射40、60、80、160 s，稀释平板计数，计算存活率。

(5)耐饥饿试验 将菌液分装至1.5 mL 离心管中，室温(25 ℃ )放置，每天稀释平板计数，计算存活率。

1.4 指标测定

生物量测定采用稀释平板记数法[5]；同步率测定采用显微计数法[5]；胞内PHB的检测采用苏丹黑染色和显微照相[6]；胞内PHB浓度测定采用紫外分光光度计测定法[6]。

2 结果与分析

2.1 苏云金芽胞杆菌BMB171及其PHB基因强化和阻断菌株在对数生长末期PHB的合成

苏云金芽胞杆菌在斜面保存中以芽孢形式存在，将芽孢接入种子培养基中复苏，复苏后接入发酵培养基中生长，对每一种苏云金芽胞杆菌都可以保证群体同步生长。通过苏丹黑染色可以发现，处于对数生长期的BMB171(BMB171+p同 )菌株菌体中能看到明显的墨黑色颗粒，而同时期的BMB171-p菌体中不存在(图1)，说明BMB171(BMB171+p同 )能正常表达产生PHB颗粒存在于体内，而PHB合成基因缺失的突变株BMB171-p不能生成PHB。通过制作3种苏云金芽胞杆菌的生长曲线可以看出，菌体中PHB合成与菌体生长偶联，PHB含量在对数生长期末期达到最大(图2)。进一步测定菌株在对数生长末期PHB的含量，详见表1。

a.BMB171(BMB171+p图略，同BMB171;b.BMB171-p图1 苏丹黑染色后处在对数生长期的3种菌菌体形态(1 000×)Figure 1 The morphology of the three kinds of logarithmic growth phase cells by sudan black staining(1 000×)

2.2 苏云金芽胞杆菌BMB171及其PHB基因强化和阻断菌株耐受试验

(1)耐热性试验 分别测定受4种温度(45、50、55、60 ℃)处理的对数生长末期营养体细胞的死亡率，计算BMB171及其PHB基因强化和阻断菌株受热死亡90%时所需要的时间(即菌体受热死亡特征值D90)，并对热处理温度作图，详见图3。

通过比较BMB171+p、BMB171和BMB171-p3菌株受热死亡特征值D90值，发现三菌株的耐热能力强弱顺序为：BMB171+pgt;BMB171gt;BMB171-p。处理温度为45 ℃ 和50 ℃时，BMB171+p、BMB171菌体的D90值(分别为32.5 min、11.5 min和25 min、9.5 min)远大于 BMB171-p菌体的D90值(12 min、6 min)，3种菌的D90值区别显著(Plt;0.01)；较高温度(55、60 ℃)时，3种菌的D90值区别不如较低温度时明显。

(2)抗冻性试验 由表2可见，将3种菌的菌体在-20 ℃下放置5 d后，BMB171+p的菌体还有108CFU/mL存活，存活率为15.91%；BMB 171菌体也有108CFU/mL存活，存活率为 14.93%；而BMB171-p菌体的活菌数降为107CFU/mL，存活率仅为0.93%。

a.BMB171;b.BMB171+p;c.BMB171-p图2 苏云金芽胞杆菌BMB171及其PHB基因强化和阻断菌株的生长曲线和PHB含量Figure 2 The contents of PHB in growth of BMB171，phaRBC overexpressed strain and phaC inhibitived strain

图3 3类菌株营养细胞在不同温度下的D90值Figure 3 The D90 of vegetative cells of three strains at the end of the logarithmic growth phase treated at different temperatures

菌株胞内PHB含量/(mg/mL)BMB171+p1.248BMB1710.844BMB171-p0.000

表2 3种菌株营养细胞冷冻耐受存活率Table 2 The survival ratio of vegetative cells of three strains at the end of the logarithmic growth phase treated by frozening

图4 BMB171及其PHB基因强化和阻断菌株菌体在紫外下照射不同时间的存活率Figure 4 The survival ratio of three kind of vegetative cells treated by ultraviolet rays at different times

图5 BMB171及其PHB基因强化和阻断菌株菌体耐饥饿存活率Figure 5 The survival rates on starvation of vegetative cells of BMB171，phaRBC overexpressed strain and phaC inhibitived strain at the end of the logarithmic growth phase treated with different day

(3)抗紫外试验 3种菌株对紫外的耐受性试验结果见图4。由图4可看出，照射40 s时，BMB171+p和BMB171菌体存活率分别为82.18%和72.67%，而BMB171-p 菌株菌体存活率只有4.12%。照射80 s后，BMB171+p 和BMB171菌体存活率基本相同，照射160 s后，活菌数为107CFU/mL ，BMB171-p 菌体存活率在照射60 s时就降为0.91% ，照射160 s后活菌数降为105CFU/mL。

(4)耐饥饿试验 由图5可知，耐饥饿试验处理1 d后BMB171的存活率为22.4%，BMB171+p的存活率为25%，BMB171-p的存活率为0.82%；2 d后分别为20.9%、23.9%和0.20%，其中，BMB171+p和BMB171菌株的活菌数仍为108CFU/mL，而BMB171-p菌株的活菌数降为107CFU/mL，且BMB171-p菌体出现自溶现象。

3 结论与讨论

本研究探讨了苏云金芽胞杆菌BMB171及其PHB合成基因增强(phaRBC+)工程菌BMB171+p和PHB合成基因阻断(phaC-)突变株BMB171-p合成PHB能力及其菌体对环境耐受性的差别。结果表明，BMB171+p和BMB171菌株均能在对数生长期合成PHB，最大量分别为1.248 mg/mL和0.844 mg/mL，而BMB171-p菌株不能合成PHB。通过取对数末期菌体进行环境耐受试验发现，在热、寒冷、紫外和饥饿环境中，BMB171+p和BMB171菌体的存活率均远远大于BMB171-p菌体，说明BMB171+p和BMB171菌体对环境的耐受性明显强于BMB171-p菌体，其中BMB171+p菌体耐受能力又略强于BMB171菌体。

由于PHB是以颗粒状和可溶性2种状态存在于菌体中，颗粒状PHB能在胞内大量储存而不影响胞内外的渗透压，是一种理想的储存材料[7]，可溶性的PHB多为低相对分子质量PHB，它被发现是细胞质[8]、质膜[9]以及线粒体和微粒体膜[10]的组成成分，并能与其它生物大分子连接在一起，在许多生物体内广泛分布[11]。本研究结果表明phaC基因的阻断导致细胞对热、冷和紫外的抗逆能力急剧下降，推测可能与低相对分子质量的PHB合成受阻，从而丧失PHB对细胞膜和细胞质有关活性成分的保护，且PHB具有不饱和双键对紫外有一定的吸收作用；PHB在菌体饥饿时可能参与了碳代谢，增强了菌体的耐饥饿能力。同时，增加胞内phaRBC基因簇拷贝数尽管大幅提高胞内PHB的合成量，但仅微弱提高菌体抗逆能力，可能是保护细胞所需的特定性状PHB量已基本满足需要。因此可以推断：苏云金芽胞杆菌中胞内PHB能增强菌体对环境的耐受性，提高菌体存活能力；并且这种能力和PHB浓度胞内的浓度有一定关系。

虽然胞内PHB存在可提高菌体抗逆能力的现象在越来越多的菌株中得到证明，但是否具有普遍性，以及PHB深层次的抗逆机制等问题还有待阐明，同时是否通过PHB合成基因的转入，构建对逆环境耐受性高的工程生物也是值得探索的课题。

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2010-04-14

严 瑾(1982-)，女，湖北孝感人，工学硕士，助教，研究方向为微生物工程.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.018

Q935

A

1673-1409(2010)02-S058-05