PPARγ激动剂抑制脂多糖诱导肾小管上皮细胞分泌趋化因子及机制

卢 颖 周 桥 仲 芳 郝 旭 李 聪 王伟铭 陈 楠

肾间质炎症反应是导致肾间质纤维化的重要因素,在肾脏病进展过程中发挥着非常重要的作用[1,2]。研究表明,包括 IL-8和单核细胞趋化蛋白 1(MCP-1)在内的趋化因子与肾间质炎症损伤有关[3-5]。在肾间质炎症反应过程中,肾小管上皮细胞既是受损伤细胞,同时也是分泌 IL-8和 MCP-1的主要细胞之一。 15-脱氧-Δ12,14-前列腺素 J2(15d-PGJ2)是过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)的天然激动剂。近年来研究发现,PPARγ激动剂可减轻肾间质炎症反应,延缓肾间质纤维化过程,而这一作用是否与抑制肾小管上皮细胞分泌趋化因子有关及相关分子机制未见报道。故本研究旨在观察15d-PGJ2对脂多糖(LPS)诱导肾小管上皮细胞趋化因子表达的影响,并探讨其可能的机制。

材料与方法

材料

细胞 人近端肾小管上皮细胞系 HK-2(购自ATCC)。

试剂 Keratinocyte-SFM细胞培养液、Trizol提取液 、Opti-MEM(美国 GIBCO),15d-PGJ2(美国 Biomol),LPS(美国 Sigma),Human MCP-1、IL-8 ELISA试剂盒(美国 Biosource),EndoFree Plasmid Maxi Kit(10)(德国 QIAGEN),Rabbit polyclonal to p-IκB(sc-101713)(美国 Santa cruz),Goat anti-rabbit IgG(HPR标记)、Goat anti-rabbit(罗丹明标记)(美国 KPL),RT相关试剂(美国 Promega)、SYBR GREEN Mix试剂盒(日本TOYOBO公司 ),lipofectamineTM2000、pcDNAγ6.2-GW/EmGFPmiPPARγ/Control质粒(美国 Invitrogen)。其他试剂均为进口或国产分析纯产品。

方法

细胞培养 HK-2细胞培养于 Keratinocyte-SFM细胞培养液中,置 37℃,5%CO2培养箱中。细胞分为(1)对照组(CON):不加任何刺激;(2)LPS组:LPS(1 μg/ml)刺激细 胞;(3)15d-PGJ2组:单纯15d-PGJ2(5μM)作用于细胞;(4)15d-PGJ2+LPS组:15d-PGJ2(5μM)预处理 2h后加 LPS刺激。上述实验均重复三次。

瞬时转染 由 invitrogen公司合成四个干扰质粒 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-miPPARγ编 号 为:mi043-1-3,mi043-2-1,mi043-3-3,mi043-4-2和一个阴性对照 micontrol。转染前 1d,将 HK-2细胞接种于六孔板中,第二天细胞长至 60%融合时进行转染。转染步骤如下:无菌 EP管中加入 Opti-MEM 250μl/管;每 EP管中加入质粒 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-miPPARγ或 micontrol 2 μg,混匀;5 μl脂质体加入 245μl Opti-MEM中,混匀,室温放置5 min;250μl质粒和 250μl脂质体溶液缓慢混匀,室温放置 20 min;吸弃六孔板内培养液,Opti-MEM洗一遍,再加入 1.5 ml Opti-MEM;六孔板内加入质粒脂质体复合物,缓慢摇匀;置于 37℃培养箱 6h后换普通培养液。上述实验均重复三次。

Real-time QPCR 荧光染料法检测 MCP-1及IL-8的 mRNA转录水平:MCP-1上游 5′-CAGCCAGATGC AATCA ATGC-3′,下游 5′-G TGGTCCATGGAATCCTGAA-3′;IL-8 上游 5′-G AATTGAA TGG GTT TGCTA G A-3′;下游 5′-CACTGT GAGGTA A GATGGTGG-3′;GAPDH上游 5′-CAGGGC TGCTTTTAACTC TGG TAA-3′;下游 5′-GGGTGGAATCATATTGG AACATGT-3′。Real-time PCR扩增按 TOKOBO SYBR GREEN Mix试剂盒说明书操作。反应条件:94℃预变性 10 min,1个循环;94℃变性 15s,62℃退火并延伸 30s,共 44个循环 72℃终末延伸 30s。每次实验设三复孔,独立实验重复三次。

ELISA LPS刺激 20h后,采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测细胞培养上清中 IL-8水平。抗人IL-8单抗包被酶标板,标准品和样品中的 IL-8与单抗结合。洗去未结合物,加入生物素化的抗人IL-8抗体,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的链亲和素(streptavidin)与生物素结合。若反应孔中有 IL-8,显色剂呈现蓝色,加中止液后变成黄色,在 450 nm处测吸光度值,通过绘制标准曲线求出样品中 IL-8浓度。相同方法检测 MCP-1浓度。

免疫蛋白印迹 采用 Pierce公司的核蛋白抽提试剂盒提取 HK-2细胞的核蛋白,用 RIPA细胞蛋白裂解液提取细胞总蛋白,并用 BCA法进行定量。蛋白质样品 30μg蛋白样品经 10%SDS-PAGE电泳,转膜,5%脱脂奶粉室温封闭 2h。加 p-IκB(1∶800)、β-actin(1∶5 000)抗体 4℃孵育过夜。以HRP标记的 IgG二抗(1∶5 000)室温孵育 2h,洗膜后,加入发光底物显色,LAS-4000成像仪自动曝光显影。计算机凝胶成像分析系统测定目的条带与内参照的吸光度值。

间接免疫荧光 LPS刺激 30 min后,吸净培养液,预温 PBS洗 5 min,3次;4%多聚甲醛 4℃固定0.5h;PBS洗 5 min,3次;0.2%TritonX-100室温穿透细胞 5 min;PBS洗 5 min,3次;1%BSA室温封闭1h;以 1∶50一抗,4℃孵育过夜;PBS洗 5 min,3次;以 1∶100比例加抗兔荧光二抗,37℃避光孵育 2h;PBS洗 5 min,3次;95%甘油封片,荧光显微镜观察。

统计学处理 计量资料数据以均数 ±标准差表示,组间比较采用方差分析,多样本均数两两比较采用 q检验,P＜0.05为差异有统计学意义。所有数据由 SPSS13.0软件进行统计分析。

结 果

15d-PGJ2对 LPS诱导 HK-2细胞分泌 IL-8和MCP-1的影响 在 HK-2细胞中,与 CON组相比,单纯 LPS刺激 4h使 IL-8、MCP-1mRNA分别升高(5.67 ±1.83)和(5.24 ±1.33)倍;若用 15d-PGJ2预处理 2h后再加 LPS刺激,与单纯 LPS刺激 4h相比,IL-8、MCP-1mRNA分别下降 74.23%、79.42%。单纯 LPS刺激 20h使培养上清中 IL-8、MCP-1分别升高 (1.62±0.12)和(2.25±0.40)倍,若用 15d-PGJ2预处理 2h再加 LPS刺激,与单纯 LPS刺激 20h相比,培养上清中 IL-8、MCP-1可分别下降69.03%、49.44%,差异均有统计学意义。而单独15d-PGJ2处理也可使上清中 IL-8、MCP-1的基础表达分别下降 31.03%,55.07%(图1)。

图1 15d-PGJ2对 LPS诱导 HK-2细胞分泌 IL-8和 MCP-1的影响

不同 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-miPPARγ对 PPARγ的沉默效率 在 HK-2细胞中分别转染四个干扰质粒 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi043-1-3,mi043-2-1,mi043-3-3,mi043-4-2和阴性对照micontrol质粒,转染 36h时细胞中 PPARγ的 mRNA表达水平分别是未转染质粒细胞的 32.11%,22.17%,27.5%,35.86%,103.8%(图 2a);转染 60h后胞核中PPARγ的蛋白表达水平分别是未转染质粒细胞的43.62%,27.74%,35.62%,51.86%,100%,可见pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi043-2-1质粒对 PPARγ沉默效率最高(图 2b),在 mRNA和蛋白分别可达77.83%,72.26%,而 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol对 PPARγ表达无明显影响。

PPARγ对 15d-PGJ2抑制 LPS诱导 IL-8和 MCP-1表达的影响 在 HK-2细胞中转染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol质粒 48h时,单纯 LPS刺激使IL-8、MCP-1mRNA和蛋白表达均显著增加;若 15d-PGJ2预处理 2h后再加 LPS刺激,与单纯 LPS刺激相比,细胞中 IL-8及 MCP-1mRNA分别下降 72.21%、68.37%;培养上清中IL-8及MCP-1分别下降 66.33%和 49.08%,差异有统计学意义。在转染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi043-2-1质粒的 HK-2细胞中,预先加入 15d-PGJ2处理 2h亦能显著抑制 LPS所致的 IL-8、MCP-1表达的增加,与 LPS组相比,细胞中 IL-8、MCP-1mRNA分别下降了 59.21%、44.08%;培养上清中 IL-8、MCP-1分别下降了 47.11%、39.4%(均 P＜0.05)(图3),差异有统计学意义。在 HK-2-pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi043-2-1细胞中,PPARγ蛋白仅表达 27.74%,但 15d-PGJ2预处理2h仍然可以显著抑制LPS诱导趋化因子表达,对IL-8和 MCP-1抑制作用分别是同组转染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol细胞的 82.06%、65.47%(mRNA水平),71.39%、79.01%(蛋白水平)。

图2 不同干扰质粒对 PPARγ沉默效率

PPARγ及 15d-PGJ2对 LPS诱导 NF-κB核易位的影响 免疫荧光检测显示,在转染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol细胞中,细胞中 NF-κB表达量很少(图 4a1),LPS刺激 30 min时 NF-κB在胞核内浓集(图 4a2),15d-PGJ2预处理 2h可明显抑制 LPS诱导的 NF-κB核易位 (图4a4)。在转染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi043-2-1细胞中,虽然 PPARγ被沉默,但与 LPS组相比,15d-PGJ2预处理 2h仍能显著抑制NF-κB核易位 (图4b)。在 转 染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol/043-2-1细胞中,与 CON组比较,单独15d-PGJ2组细胞中 NF-κB表达显著增加 ,但主要分布在胞质,胞核中很少(图 4a3,4b3)。

15d-PGJ2对 LPS诱导的 IκBα磷酸化的影响与 CON组比较,LPS组 IκBα磷酸化水平明显升高(P＜0.05);在转染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol及未转染质粒的 HK-2细胞中,与 LPS组相比,15d-PGJ2+LPS组胞质中 p-IκBα显著减少,差异有统计学意义。在转染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi043-2-1细胞中,15d-PGJ2预处理仍然可抑制 LPS诱导的 IκBα磷酸化,与同组转染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol和未转染质粒细胞相比无明显差异(图5)。

图3 PPARγ对 15d-PGJ 2抑制 LPS诱导 IL-8和 MCP-1表达的影响

图4 PPARγ及 15d-PGJ 2对 LPS诱导 NF-κB核易位的影响

讨 论

PPARγ是一类配体依赖性核转录因子超家族成员之一,15d-PGJ2是其天然配基,最初的研究发现其在调节脂肪细胞分化和胰岛素敏感性方面发挥重要作用。近年来,在糖尿病肾病[6,7]和非糖尿病肾病动物模型[8,9]中均发现 PPARγ激动剂可减轻肾间质炎症反应,延缓肾间质纤维化过程,然而PPARγ激动剂抑制肾间质炎症反应的具体分子机制尚未完全探明。有研究者发现在糖尿病大鼠和5/6肾切除大鼠模型中,肾间质中趋化因子 IL-8和MCP-1表达显著增加[10-12]。Lehrke和 Lazar[13]认为 MCP-1和 IL-8的表达上调与肾间质炎症反应密切相关。在本研究中,我们发现 LPS刺激肾小管上皮细胞 4h后,细胞上清中 IL-8、MCP-1蛋白表达分别增加(1.62±0.12)、(2.25±0.4)倍,与以往研究相符[14,15]。而 15d-PGJ2预处理 2h可以显著抑制LPS诱导的 IL-8和 MCP-1表达的增加。据此我们推测 PPARγ激动剂可能通过抑制肾小管上皮细胞分泌趋化因子 IL-8和 MCP-1,减少相应的效应细胞(如单核/巨噬细胞、T细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞)浸润至肾间质,进而降低相关的炎症因子[如肿瘤坏死因子 α(TNF-α)、IL-1、IL-6等]和生长因子[如转化生长因子 β(TGF-β)和血小板衍生生长因子(PDGF)等]表达,从而减轻肾间质炎症损伤。

以往研究表明 PPARγ激动剂对炎症反应的抑制作用包括依赖 PPARγ和不依赖 PPARγ两个方面[16-18]。为了进一步研究 15d-PGJ2对 LPS诱导的趋化因子表达的影响是否依赖于 PPARγ,我们用siRNA干扰技术沉默 HK-2细胞中 PPARγ。在转染pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi control的 HK-2细胞中,PPARγ正常表达,15d-PGJ2预处理 2h可显著抑制LPS诱导的 IL-8和 MCP-1表达;在转染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi043-2-1质粒 HK-2细胞中,PPARγ蛋白仅表达 27.74%,15d-PGJ2预处理 2h仍然可显著抑制 LPS诱导肾小管上皮细胞分泌 IL-8和MCP-1,其对 IL-8和 MCP-1抑制作用分别是同组转染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol细 胞 的82.06%、65.47%(mRNA水平),71.39%、79.01%(蛋白水平)。故我们认为 15d-PGJ2对趋化因子表达的抑制作用不完全依赖于 PPARγ。

图5 15d-PGJ2抑制 LPS诱导的 IκBα磷酸化

LPS激活的炎症通路中以NF-κB通路最为重要。LPS通过激活细胞膜表面 TLR4,活化 IKK激酶,使IκB磷酸化,进而迅速泛素化降解,NF-κB被活化并易位至细胞核内,与靶基因上游调控序列相结合,激活下游基因转录[18,19]。本研究中,间接免疫荧光结果显示 15d-PGJ2可通过不依赖于 PPARγ的方式抑制LPS诱导的 NF-κB核易位。进一步研究发现15d-PGJ2可以通过不依赖于 PPARγ的方式抑制胞质中 I-κB磷酸化,进而抑制 NF-κB的核易位。据此我们认为,15d-PGJ2进入细胞后可直接抑制 I-κB磷酸化,减少 I-κB的泛素化降解,进而抑制 NF-κB活化和核易位,从而减少下游IL-8和 MCP-1转录,且以上作用不依赖于核受体 PPARγ。此外,与 CON组比较,15d-PGJ2组的细胞中 NF-κB表达显著增加,但主要分布在胞质,胞核中很少。我们推测这可能与 15d-PGJ2抑制趋化因子表达,使得 NF-κB代偿性增加有关。

综上所述,本研究进一步探明了 PPARγ激动剂减轻肾间质炎症反应的分子机制,即 PPARγ激动剂15d-PGJ2能够以不依赖核受体 PPARγ的方式抑制LPS诱导肾小管上皮细胞分泌趋化因子 IL-8和MCP-1,这一作用与抑制 IκB磷酸化有关,这为PPARγ激动剂干预肾脏炎症提供了理论依据。

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