浙江省蝴蝶兰细菌性软腐病病原鉴定

吴志毅，方 媛，陈 曦，张慧丽，张明哲，李 斌

(1.浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江 杭州310012；2.浙江大学 生物技术研究所 农业部作物病虫分子生物学重点开放实验室，浙江 杭州310029；3.宁波出入境检验检疫局，浙江 宁波315012)

蝴蝶兰Phalaenopsis细菌性软腐病是国内外蝴蝶兰生产上的一大障碍，病原学研究进一步显示假单胞细菌 Pseudomonas sp.[1]，菊欧文氏菌 Erwinia chrysanthemi[2]和 大白菜 软腐病 菌 Erwinia carotovora subsp.carotovora[3]都能引起该病害的发生。2007年上半年，在浙江省杭州市浙江大学华家池校区花卉苗圃栽培的蝴蝶兰上出现的细菌病害，初期主要危害叶片，不论新叶或老叶都会发生，叶片感染后出现水浸状斑点，随即迅速扩大，感病部位内部组织被细菌分解成液体状态，叶片失去支撑力而下垂。水浸状病斑处颜色较深，与浅绿色健康组织有明显区别。腐烂处发出臭气，然后病部组织崩溃，内溶物流出，病叶呈纸状干枯。高温、高湿、不通风的环境容易诱发该病的发生。病部切片在低倍显微镜下均能观察到喷菌现象。为明确浙江省蝴蝶兰细菌性软腐病到底是由哪一种病菌引起，为蝴蝶兰病害的有效治理提供切实可行的依据，笔者对该病开展了病原鉴定研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标准菌株与病原细菌分离

菊欧文氏菌标准菌株，Erwinia chrysanthemi ATCC11662和SCH-1分别由上海市出入境检验检疫局和浙江大学生物技术研究所提供。其他参考标准菌株Xanthomonas axonopodis pv.poinsettiicola LMG 849和LMG5401以及Pseudomonas syringae pv.syringae LMG5570和LMG2231均由比利时根特大学国家菌种保藏中心提供。首先，镜检样本上是否有其他可见病原物，然后取无真菌菌丝或孢子的典型病株样本3份。病部叶表经体积分数为70%乙醇消毒后，在肉汁胨培养基(NA)上划线分离，平板在28℃下培养3 d后于挑取代表菌落进行进一步测试。

1.2 病原的常规细菌学及Koch假说测定

菌落形态、培养性状、烟草过敏性反应及Koch假说测定按Klement等[4]方法；生理生化测定按Schaad等[5]方法。离体致病性测定参照Yessad等[6]的方法进行。Koch氏病原假说测定的蝴蝶兰品种为 “火鸟”，将所测菌株浓度调节到1011个°L－1，采用针刺法在蝴蝶兰的叶片上接种，5 d后开始记录发病情况。接种后放置28℃的人工气候箱内培养。

1.3 病原的Biolog鉴定

选取3株有代表性的菌株，分别命名为H-1，H-2和H-3，用Biolog进行证实，在含95个碳源的Biolog阴性(GN)微孔板中，加入150 mL°孔-1所测细菌悬浮液(吸光度值0.3)。在30℃下培养24 h后由Biolog读数机测得反应结果，并直接进入Biolog专用细菌鉴定程序(4.1版本)。具体操作参照文献[7－8]的方法。

1.4 病原的脂肪酸甲基酯(FAME)鉴定

FAME鉴定采用Agilent 6890型气相色谱系统。参照MIDI公司说明书及文献[7－8]的方法进行。所有纯化的参试菌株先在NA培养基上于30℃生长24 h后，转入TSBA固体培养基上再培养24 h。然后用无菌塑料接种环挑取1环培养菌放入有螺帽的试管中，提取脂肪酸。鉴定结果通过微生物鉴定系统软件——MIDI公司开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定细菌的MIS 4.5(microbial identification system)和LGS 4.5(library generation software)获得。把结果与数据库中标准菌种的脂肪酸信息进行比对。

1.5 16S基因序列分析

根据已发表[9]的植物病原细菌16S的通用引物对分离的致病细菌进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，正反向引物分别为: P1 (5’-GTTACCGACAGAATAAGCACCC-3’ )和 P2(5’-CCTACGGCTACCTTGT TACGAC-3’ )。扩增反应体积 20.0 μL: DNA 模板 1.0 μL； P1(10.0 μmol°L－1)0.5 μL； P2(10.0 μmol°L－1)0.5 μL； 2 × Taq PCR StarMix 10.0 μL，双蒸水补足至 20.0 μL。反应条件为 94 ℃预变性 5 min；94℃变性25 s，65℃退火25 s，72℃延伸l min，共35个循环；72℃延伸5 min；最后4℃保存。PCR反应在PTC-200型热循环仪上进行，取5.0 μL反应液在10.0 g°kg－1琼脂糖凝胶上进行电泳检测，得到1.5 kb左右大小的条带。将PCR产物送华大生物技术责任公司克隆并测序。将得到的测序结果在 GenBank(登录 http: //www.ncbi.nlm.nih.gov)进行 blast比对。

1.6 16S基因聚类分析

以测序得到的3条16S序列为材料，利用ClustalX软件将测得的16S序列与已报道的菊欧文氏菌和相近属种的18条16 S序列进行序列对齐和同源性序列的多重排定，MEGA 3.1构建分子系统树。根据Kimura双参数模型计算遗传距离，相应的标准误差用Bootstrap方法(replications=1 000)，NJ，MP，ME和UPGMA系统树通过MEGA 3.1软件得出，系统树中节点的自举置信水平(bootstrap confidence level，BCL)应用自引导(bootstrap)估计，共1 000次循环。

2 结果与分析

2.1 病原的细菌学特征

来自不同样品的3株蝴蝶兰分离菌株的革兰氏染色反应均为阴性，菌体杆状，具周生鞭毛3～8根，能游动，兼性厌氧，不产生芽孢。在NA培养基上于28℃生长3 d，菌落乳白色，扁平，褶皱有光泽，大小0.5～1.0 μm ×1.0～3.0 μm。在 KMB(Kings Medium B Agar)培养基上不产生荧光色素。它们与菊欧文氏菌标准菌株Erwinia chrysanthemi ATCC11662和SCH-1的反应基本一致。

2.2 致病性测定

将3株蝴蝶兰软腐病分离细菌与2株菊欧文氏菌标准菌株E.chrysanthemi ATCC11662和SCH-1的菌液浓度调至1 011个°L－1的菌悬液接种烟草Nicotiana tabacum，观察其过敏性反应。结果发现，所有菌株在接种后24 h后均产生明显的过敏性反应，呈灰色晕圈，而无菌水对照无过敏性反应。Koch氏测定表明，在接种后的第3～4天，蝴蝶兰叶片发病，病状为水渍状病斑，呈半透明状，组织软腐，有恶臭味。从接种发病的病叶上分离获得同样病原。

2.3 Biolog鉴定

2个标准菊欧文氏菌菌株的Biolog鉴定结果与原鉴定完全一致，其相似性分别为0.85和0.76。3株蝴蝶兰分离菌代表菌株的Biolog测定结果显示，它们均被鉴定为Erwinia chrysanthemi，Biolog相似性在0.77～0.82，接近或超过标准菌株，具有很高的可信度(表1)。

表1 3株蝴蝶兰软腐病细菌与标准菌株的Biolog鉴定结果Table 1 Biolog identity of 3 soft rot bacteria of moth orchid and standard reference strains

2.4 病原菌的脂肪酸甲基酯(FAME)鉴定结果

FAME鉴定结果匹配程度遵循Buyer等的原则:相似性系数＜0.2，结果不可用；相似性系数≥0.5，鉴定到种。6个标准菌株和3株蝴蝶兰软腐病细菌的FAME鉴定结果与Biolog鉴定完全一致(表2)，其中2株Erwinia chrysanthemi标准菌株的FAME相似度在0.84和0.79，3株蝴蝶兰软腐病细菌的FAME相似度在0.67～0.75，均接近或超过标准菌，表明本次FAME鉴定结果真实可靠。

2.5 病原菌的16S序列分析

登录GenBank进行序列比较，结果表明，3株检测菌株与E.chrysanthemi，Dickeya dadantii的同源性均高达99%。但根据上述的细菌学特征、Biolog和FAME分析鉴定及其在蝴蝶兰上的致病性测定(后一种病原在蝴蝶兰上不致病)，可以排除后一种病原细菌的可能性。

表2 3株蝴蝶兰软腐病细菌与标准菌株的脂肪酸鉴定结果Table 2 FAME identity of 3 soft rot bacteria of moth orchid and standard reference strains

图1 蝴蝶兰细菌性软腐病菌与相近种的16S基因分子系统树Figure 1 Phylogenetic tree derived from the 16S rDNA gene sequences analysis between soft rot bac teria of moth orchid and related species

2.6 16S基因的聚类分析

根据Kimura双参数模型，用NJ法构建的的16S rDNA基因的分子系统树(图1)。图1表明，3株检测菌株的16S序列与Erwinia chrysanthemi标准菌株以较高的自举置信值聚在一起，而与其他属种分离开来。充分说明本研究中引起蝴蝶兰软腐的病原菌是E.chrysanthemi，并证实了前面的实验结果。

3 讨论

经过对来自不同蝴蝶兰植物样品的3个分离菌株的主要细菌学特性、菌落形态、致病性、Biolog、FAME鉴定，16S序列分析及与2个标准菌株的比较，证实了在杭州市出现的蝴蝶兰软腐是由E.chrysanthemi引起的。本研究未发现蝴蝶兰植物样品中有其他病原细菌的存在。

由于Pseudomonas sp.，Erwinia carotovora sp.carotovora和E.chrysanthemi都已经被报道能引起蝴蝶兰软腐病的发生，在植物上表现的症状也比较相似。此时，全面了解这3种病菌特别是后2种病菌在菌落形态上的区别，对于及时准确地识别到底是哪一种病菌引起的蝴蝶兰软腐病非常必要。E.carotovora sp.carotovora病菌在大多数培养基上的菌落是淡灰白色至乳酪色，光滑、圆形，有光泽，轻微隆起，在24 h后出现肉眼可见菌落。E.chrysanthemi病菌虽然在大多数培养基上的菌落也呈淡灰白色至乳酪色，光滑、圆形，但边缘渐变成波状至羽毛状，较扁平或轻微隆起，在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上3～6 d后，菌落似 “煎鸡蛋”状，中央突起并有波状边缘；另外在葡萄糖碳酸钙(YDC)培养基上培养5～10 d后很多菌株产生深蓝色非水溶性色素。

3株蝴蝶兰分离菌株和2个对照菌株的Biolog图谱和FAME脂肪酸图谱都和数据库中的Erwinia chrysanthemi病菌显示了非常高的相似性，显示了这2种技术都可以应用于浙江蝴蝶兰细菌性软腐病菌的鉴定研究。同时，浙江蝴蝶兰细菌性软腐病菌与相近种的分子系统发育树显示E.chrysanthemi与E.carotovora sp.carotovora病菌在16S序列上差异明显，这为分别设计特异性引物检测这2种病原细菌提供了可能。此外，Li等[10]报道了Erwinia chrysanthemi病菌引起杭州地区石斛兰Dendrobium的茎腐病，然而笔者的研究则是第1次发现该病菌引起浙江地区蝴蝶兰的软腐病，究竟从不同寄主如石斛兰和蝴蝶兰上分离的病菌间是否存在遗传多样性，仍有待进一步研究。

[1]李艳梅，陈超，李小六，等.引起蝴蝶兰软腐病的病原菌菌株的分离鉴定[J].北京农学院学报，2004，19(4):40－42.LI Yanmei，CHEN Chao，LI Xiaoliu，et al.A new strain of pathogen isolated from soft-rotting of Phalaenopsis [J].J Beijing Agric Coll，2004，19 (4): 40－42.

[2]林汉锐，钟融融.蝴蝶兰病害防治[J].广东园艺，2003，4(1):46－47.LIN Hanrui，ZHONG Rongrong.Disease control of Phalaenopsis [J].Guangdong Hortic，2003，4 (1): 46－47.

[3]徐建新，丁峰，孙莉，等.蝴蝶兰细菌性软腐病的发生与防治[J].江苏农业科学，2006(4):65.XU Jianxin，DING Feng，SUN Li，et al.Incidence and control of bacterial soft rot of Phalaenopsis [J].Jiangsu Agric Sci，2006 (4): 65.

[4]KLEMENT Z，RUDOLPH K，SANDS D C.Methods in Phytobacteriology [M].Budabest: Akademiai Kiado，1990.

[5]SCHAAD N W，JONES J B，CHUN W.Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria [M].3rd Ed.Minnesota: American Phytopathological Society，2001.

[6]YESSAD S，MAUCEAN C AND LUISETTI J.A detached leaf assay to evaluate vilnalence and pathogenicity of strains of Pseudomona.syringae pv.syringae on pear[J].Plant Dis，1992，76: 370－373.

[7]苏婷，龙那葩，罗士波，等.浙江省红掌细菌性疫病病原鉴定[J].浙江林业科技，2008，28(6):40－42.SU Ting，RUNGNAPHA K，LUO Shibo，et al.Identification of pathogenic bacteria of new bacterial disease damaged to Anthurium andraeanum in Zhejiang Province [J].J Zhejiang For Sci Technol，2008，28 (6): 40－42.

[8]徐丽慧，徐福寿，李芳，等.桑细菌性青枯病病原及其生化型鉴定[J].植物保护学报，2007，34(2):141－146.XU Lihui，XU Fushou，LI Fang，et al.Identification of the causal organism of bacterial wilt of mulberry and its biovars[J].Acta Phyto Sin，2007，34 (2): 141－146.

[9]LI B，XIE G L，ZHANG J Z，et al.Identification of the bacterial leaf spot pathogen of poinsettia in China [J].J Phytopathol，2006，151: 711－715.

[10]LI B，QIU W，FANG Y，et al.Bacterial stem rot of oncidium orchid caused by a Dickeya sp.(ex Pectobacterium chrysanthemi) in mainland China [J].Plant Dis，2009，93 (5): 552.