正交试验优选二氢青蒿素脂质体的制备工艺

温 悦，孟德胜，毕小婷（第三军医大学大坪医院野战外科研究所药剂科，重庆市 400042）

正交试验优选二氢青蒿素脂质体的制备工艺

温 悦＊，孟德胜#，毕小婷（第三军医大学大坪医院野战外科研究所药剂科，重庆市 400042）

目的：优选二氢青蒿素脂质体的制备工艺。方法：以大豆磷脂与胆固醇的质量比、脂质与药物的质量比、水合溶液的种类为考察因素，以包封率为评价指标，利用正交试验优选制备工艺。结果：优选的工艺为采用薄膜-超声法，大豆磷脂与胆固醇的质量比为5∶1，脂质与药物的质量比为5∶1，以0.9%NaCl注射液为水合溶液。制得的脂质体形态均匀，包封率＞85%。结论：该制备工艺和处方可以得到高包封率和稳定的二氢青蒿素脂质体。

二氢青蒿素；脂质体；包封率；质量评价；正交试验

二氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿的提取物青蒿素及其衍生物在体内的活性代谢产物和有效成分，是一种水溶性很好的青蒿素衍生物，其药理作用强度是青蒿素的4～8倍。研究表明[1]，除有抗疟活性外，DHA还可抑制细胞血管内皮生长因子表达，增强胶质瘤的放射敏感性，对人体乳腺癌细胞具有选择性毒性。有学者发现[2]，DHA对正常人乳腺细胞HTB125无明显的细胞毒作用，但对放射抗拒的人乳腺癌细胞系HTB27表现了很强的杀伤能力。该结果提示，DHA是一种很有前途的抗乳腺癌药物。

DHA脂质体将脂质体的缓控释作用及内化快等特点集于一身，具有靶向治疗效果[3]，不仅可以减少毒副作用，还可以保护DHA在到达靶细胞或靶组织之前不被体内的活性物质所代谢而降低抗癌活性。为此，本试验采用薄膜-超声法[4]，以大豆磷脂、胆固醇为膜材，将DHA制备成脂质体，并对其处方、工艺及有关性质进行研究。

1 仪器与材料

RE-5298A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-500型医用超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Cs-15R型低温离心机、DU-650型紫外分光光度计（美国贝克曼公司）；SPM-10A型数字酸度计（浙江萧山仪器标准件厂）。

注射用大豆磷脂（上海太伟药业有限公司，批号：060727）；胆固醇（上海伯奥生物科技有限公司，批号：050106）；DHA（浙江义乌高登精细化工有限公司，批号：051028，纯度：99.3%）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 制备方法选择

通过预试验对逆相蒸发法和薄膜-超声法进行比较，发现采用逆相蒸发法制备的DHA脂质体比用薄膜-超声法制备的脂质体包封率低。笔者为获得较高包封率的DHA脂质体，故选择薄膜-超声法。

2.2 正交试验设计

通过有关文献[5]及单因素考察试验，确定了影响DHA脂质体包封率的3个主要因素，即大豆磷脂与胆固醇的质量比（A）、脂质与药物的质量比（B）、水合溶液的种类（C），并选用L9（34）正交表安排试验，每个因素选取3个水平。因素水平见表1。

表1 因素水平Tab 1 Levels and factors

2.3 包封率测定

2.3.1 DHA脂质体混悬液的制备 用薄膜-超声法制备，按表1中的条件，处方其余各原料用量固定。精密称取大豆磷脂、胆固醇、DHA各适量，置于圆底烧瓶中，加入3mL三氯甲烷使溶解，于40℃减压旋转蒸发，转速为60r·min-1，使脂质体在瓶内壁均匀成膜，15min后即得干燥脂膜，备用。向上述薄膜中加入20mL PBS，置于超声清洗器中超声40min，即得DHA脂质体混悬液。

2.3.2 标准品溶液的制备 精密称取DHA约0.01g，置于100mL量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀后静置2h，制成浓度为0.101mg·mL-1的标准品溶液。

2.3.3 最大吸收波长的确定 以乙醇为空白，将标准品溶液在200～400nm波长范围内进行紫外扫描，同时将空白脂质体的原料大豆磷脂和胆固醇用适量的乙醇和氯仿溶解后在200～400nm波长范围内也进行扫描。结果，标准品溶液在237nm波长处有最大吸收，此波长处大豆磷脂和胆固醇对其测定无干扰，故选定237nm为测定波长。DHA紫外扫描图谱见图1。

图1 DHA紫外扫描图谱1.空白基质；2.DHAFig 1 UV scanning spectrum of DHA 1.blank matrix；2.DHA

2.3.4 标准曲线的制备 分别取标准品溶液1、2、3、4、5mL，置于25mL量瓶中，加2%NaOH溶液-无水乙醇（4∶1，V/V）混合溶液至刻度，摇匀，置于60℃恒温水浴中反应30min，取出，冷至室温，即得浓度依次为4.04、8.08、12.12、16.16、20.20μg·mL-1的标准溶液。在237nm波长处测定吸光度，以吸光度（X）为横坐标，DHA的检测浓度（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y＝29.4125X－0.03973（r＝0.9997）。结果表明，DHA检测浓度在4.04～20.20μg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验 取低、中、高3个浓度的标准品溶液，按“2.3.4”项下方法进行处理，在237nm波长处测定吸光度，分别测定5次。结果，低、中、高3个浓度的样品RSD分别为0.32%、0.59%、0.11%（n均为5），表明仪器精密度良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取处方量的大豆磷脂和胆固醇，加入DHA约0.01g，按“2.3.4”项下方法进行处理，制备样品6份，在237nm波长处测定吸光度，计算加样回收率。结果，平均回收率为99.92%，RSD＝3.72%（n＝6）。

2.3.7 包封率的测定 取适量DHA脂质体混悬液，13000r·min-1离心20min，分别精密量取离心上清液和未离心混悬液各1mL，分别置于10mL量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀。静置2h后各取3mL，分别置于25mL量瓶内，用2%NaOH溶液-无水乙醇（4∶1，V/V）定容，摇匀，60℃水浴反应30min，取出，冷至室温，待用。分别将各组离心和未离心稀释溶液在237nm波长处以2%NaOH溶液-无水乙醇（4∶1，V/V）为空白测定吸光度，根据标准曲线求得游离药物量（W游）和药物总量（W总），按下式计算包封率：包封率＝（W总－W游）/W总×100%。

2.4 正交试验结果

以包封率为评价指标，筛选最佳制备工艺。正交试验结果见表2；方差分析结果见表3。

表2 正交试验结果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis

由表3可以看出，各因素的水平变化对包封率无显著的影响，这一结果与笔者经单因素考察后的预期试验结果不符，可能是由于最后的极差计算时只依赖于指标值，一旦某点或某几点的指标值误差较大，势必会影响计算结果的可靠性，进而影响试验结果分析的正确性，故而需要进一步试验验证。但由表2直观分析可以看出，对包封率的影响因素大小依次为C＞B＞A，故暂定最优水平搭配为A3B2C3。

2.5 验证试验

按优选工艺制备3批DHA脂质体，光学显微镜下观察，脂质体为粒径较均匀的球状或近球状小囊泡，粒径小而均匀。按“2.3”项下方法测定包封率。结果，平均包封率为88.47%，RSD＝0.90%（n＝3），表明在优选的工艺下制得的DHA脂质体包封率均在85%以上，且重现性较好。

2.6 稳定性考察

取制得的一批DHA脂质体样品，测定其包封率为90.55%，分别在4℃和室温条件下放置24h，对其包封率的变化进行考察。结果，DHA脂质体在4℃条件下保存24h，包封率为90.13%；室温下保存24h后，包封率为87.5%。可见，4℃条件下保存的稳定性高于在室温条件下保存。

3 讨论

本试验所用的膜材为大豆磷脂（注射用）和胆固醇，其中胆固醇的加入可调节膜的流动性：一定比例的胆固醇可减小膜的流动性，增加脂质体的稳定性，从而提高包封率。本试验研究结果表明，在大豆磷脂（注射用）与胆固醇质量比为5∶1时包封率较高。

本试验中药物与脂质的质量比也是影响脂质体包封率的一个主要因素。试验中发现，药物浓度过高或过低都会影响其包封率，随着药物浓度的升高，包封率先升高后降低，提示DHA脂质体的包封率可能具有饱和性[6]。

试验发现，在0.9%NaCl注射液中DHA脂质体最稳定，这可能是在制备DHA脂质体时大豆磷脂的水解受缓冲液pH值的影响，与其水解速度常数有关[7]。

[1] 李 菌，周慧君.DHA可抑制K562细胞血管内皮生长因子的表达[J].药学学报，2005，40（11）：1041.

[2] Singh NP，Lai H.Selective toxicity of dihydroartemisinin and holotransferrin toward human breast cancer cells[J].Life Sci，2001，70：49.

[3] 马宏达，郭 涛.脂质体靶向载药系统研究进展[J].中国药房，2004，15（11）：697.

[4] 陆 彬.药物新剂型与新技术[M].北京：人民卫生出版社，1998：108.

[5] 郭海燕，莫穗材.脂质体物理稳定性和包封率的影响因素[J].中国新药杂志，2004，13（6）：498.

[6] Gulati M，Grover M，Sigh M，et al.Study of azathioprine encapsulation into liposomes[J].J Microencapsule，1998，15（4）：485.

[7] 王长虹，孙殿甲.脂质体的物理化学稳定性研究进展[J].中国药学杂志，1998，33（2）：65.

Optimization of the Preparation Technology of Dihydroartemisinin Liposome by Orthogonal Test

WEN Yue，MENG De-sheng，BI Xiao-ting（Dept.of Pharmacy，Research Institute of Field Surgery，Daping Hospital of Third Military Medical University，Chongqing 400042，China）

OBJECTIVE：To optimize the preparation technology of dihydroartemisinin liposome.METHODS：The preparation technology of dihydroartemisinin liposomes was optimized by orthogonal test with ratio of granulesten to cholesterol，ratio of lipid to drugs and types of aqueous solution as factors and using encapsulation efficiency as index.RESULTS：Film-ultrasound method was used to optimize the preparation method.The optimal preparation technology was as follows：ratio of granulesten to cholesterol was 5∶1，ratio of lipid to drugs was 5∶1and 0.9%NaCl injection was used as aqueous solution.Prepared liposome was uniform in shape with encapsulation efficiency more than 85%.CONCLUSION：The method can be used to prepare stable dihydroartemisinin liposome with high encapsulation efficiency.

Dihydroartemisinin；Liposome；Encapsulation efficiency；Quality evaluation；Orthogonal test

R283.69；R283

A

1001-0408（2010）43-4069-03

＊主管药师，硕士。研究方向：药物新剂型和新技术。电话：023-68757194-8014。E-mail：wmonica@163.com

#通讯作者：副主任药师。研究方向：医院药学与创新药物。电话：023-68757091。E-mail：mengdes@126.com

2009-10-29

2010-06-04）