5-LOX基因沉默对人胰腺癌细胞SW1990裸鼠移植瘤生长的影响

秦金丹 周国雄 黄介飞 丁晓凌 张海峰 张弘

·论著·

5-LOX基因沉默对人胰腺癌细胞SW1990裸鼠移植瘤生长的影响

秦金丹 周国雄 黄介飞 丁晓凌 张海峰 张弘

目的观察裸鼠的人胰腺癌细胞SW1990移植瘤内注射靶向5-脂氧合酶(5-LOX)的短发夹RNA(shRNA)对移植瘤以及瘤组织5-LOX和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响，探讨其临床应用价值。方法将胰腺癌细胞SW1990接种至裸鼠背部皮下，待移植瘤生长至100 mm3左右后随机分为shRNA1组、shRNA2组、阴性对照shNC组和脂质体组。每组6只，雌雄各半。实验组瘤内注射相应shRNA 50 μg/次，1次/3 d，共7次。对照组瘤内注射脂质体液100 μ1/只。每3 d测体重及移植瘤长、短径一次。第29天处死动物，取肿瘤组织，称瘤重。应用免疫组化和RT-PCR法检测移植瘤组织5-LOX、VEGF的mRNA和蛋白的表达。结果shRNA1组、shRNA2组、shNC组和脂质体组的瘤重分别为(32.5±19.0)mg、(30.1±14.1)mg、(50.5±15.6)mg和(71.7±25.4)mg，shRNA1组、shRNA2组、shNC组抑瘤率分别为54.7%、58.0%和29.5%，shRNA1组、shRNA2组较shNC组和脂质体组相差显著(P值均<0.05)。shRNA1组和shRNA2组移植瘤的5-LOX、VEGF mRNA和蛋白的表达较shNC组和脂质体组均显著减少，但两治疗组之间未见明显差异，shNC组和脂质体组之间也无明显差异。结论靶向5-LOX的RNA干扰治疗通过直接抑制5-LOX的表达、间接抑制VEGF的表达而抑制SW1990裸鼠移植瘤的生长。

胰腺肿瘤； RNA干扰； 5-脂氧合酶； 血管内皮生长因子

早期的流行病学调查显示,高脂饮食尤其是不饱和脂肪的摄入与胰腺癌的发生有关[1-2]。最近的研究证实,5-脂氧合酶(5-LOX)代谢途径的异常是多种肿瘤发生发展的重要原因之一[3]。5-LOX抑制剂对胰腺癌细胞具有抑制作用[4]。RNA干扰(RNA interference, RNAi) 技术是近年来新兴的一种可以快速、高效地促使体内特定基因mRNA降解,实现基因转录后沉默的方法[5]。我们先前的研究表明，靶向5-LOX的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)真核表达载体转染人胰腺癌细胞株SW1990可以特异地抑制细胞5-LOX的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞的凋亡[6]。本实验通过体内实验观察靶向5-LOX的shRNA治疗胰腺癌移植瘤的效果，为其临床应用提供实验依据。

材料与方法

一、靶向5-LOX的shRNA表达载体的构建

由上海吉玛公司构建两对针对5-LOX基因的shRNA及一对阴性对照shRNA(shNC)。ALOX5-1021(shRNA1)正义链5′-CACCGCTCCCATCTGCTT-GCTGTATTTCAAGAGAATACAGCAAGCAGATGGGA-GCTTTTTTG-3′，反义链5′-GATCCAAAAAAGCTCCCATCTGCTTGCTGTATTCTCTTGAAATACAGCAAG-CAGATGGGAGC-3′；ALOX5-315(shRNA2)正义链5′-CACCGCGCAAGTACTGGCTGAATGATTCAAGAG-ATCATTCAGCCAGTACTTGCGCTTTTTTG-3′，反义链5′-GATCCAAAAAAGCGCAAGTACTGGCTGAATGAT-CTCTTGAATCATTCAGCCAGTACTTGCGC-3′(1021、315是设计的shRNA的靶基因位点起始位置)；shNC正义链5′-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACAC GTTCGGAGAATTTTTTG-3′，反义链5′-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTG ACGTGACACGTTCGGAGAAC-3′。3组shRNA分别插入pGPU6/GFP/Neo质粒。

二、胰腺癌移植瘤动物模型的建立及分组

人胰腺癌细胞SW1990(中分化)购自上海肯强公司。常规培养传代。待细胞长至瓶底80%～90%，胰酶消化收集细胞，加入无血清DMEM培养基。锥虫蓝染色计数，活细胞比例>98%，则调整活细胞浓度为1×108个/ml，分装于1 ml的无菌EP管中备用。

BALB/c nu/nu裸鼠购自中国人民解放军南京军区医学动物实验中心。皮肤消毒后，于裸鼠右侧腋下注射0.1 ml SW1990细胞悬液。待移植瘤长至约100 mm3时(11 d左右)分为shRNA1组、shRNA2组、shNC组和脂质体组。每组6只，雌雄各半，分笼饲养。实验组瘤内注射相应shRNA 50 μg/次，1次/3 d，共7次。对照组瘤内注射脂质体液100 μl/只。每3 d用体重计测量体重一次，用游标卡尺测量移植瘤的长、短径一次。第29天处死动物，取肿瘤组织，称瘤重。

三、观察指标

1．肿瘤体积及抑瘤率：肿瘤体积V=1/2×ab2，a为肿瘤最大长径，b为肿瘤短径[7]。抑瘤率(%)=(1-实验组瘤重/对照组瘤重)×100%。

2．移植瘤组织5-LOX、VEGF蛋白表达的检测：采用免疫组化方法。肿瘤细胞胞质及胞膜出现棕黄色颗粒为表达阳性细胞。评分标准：按染色强度，无色为0分，弱阳性为1分，中度阳性为2分，强阳性为3分；按阳性细胞百分率，无阳性细胞为0分，阳性细胞率≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～80%为3分，>80%为4分。二者相乘得0为-，1～4分为+，5～8分为++，9～12分为+++。

3．移植瘤组织5-LOX、VEGF mRNA表达的检测：采用RT-PCR方法。先用Trizol试剂提取移植瘤组织总RNA，再逆转录成cDNA。5-LOX上游5′-TCATCGTGGACTTTGAGCTG-3′，下游5′-AGAAGGTGGGTGATGGTCTG-3′，产物262 bp；VEGF上游5′-GGGCCTCCGAAACCATGAACTT-3′，下游5′-TCGCATCAGGGGCACACAG-3′，产物260 bp。 β-actin上游5′-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3′，下游5′-ATGCATTCACCTCCCCTGTG-3′，产物 486 bp，均由上海invitrogen公司合成。PCR反应条件： 94℃ 5 min，94℃ 40 s、54℃ 55 s、72℃ 60 s，36个循环(5-LOX)或94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 40 s，30个循环(VEGF)，最后72℃延伸。产物经琼脂糖电泳分离。

四、 统计学处理

结 果

一、shRNA的抑瘤效应

给予shRNA1和shRNA2 治疗后，肿瘤的生长速度减慢，体积小于同时间的shNC 组和脂质体组(图1)。移植后第30天，shRNA1组平均肿瘤体积是用药前的3.11倍，shRNA2组是2.84倍，shNC组是5.34倍，脂质体组是7.01倍。shRNA1组、shRNA2组、shNC组和脂质体组的瘤重分别为(32.5±19.0)mg、(30.1±14.1)mg、(50.5±15.6)mg和(71.7±25.4)mg；shRNA1组、shRNA2组、shNC组抑瘤率分别为54.7%、58.0%和29.5%。治疗组与对照组相差显著(P值均<0.05)。

图1 各组肿瘤生长曲线

二、移植瘤5-LOX、VEGF蛋白表达的变化

5-LOX主要定位于移植瘤细胞的胞质，在胞核及核膜上亦可见表达，呈棕黄色。shRNA1和shRNA2组移植瘤的5-LOX蛋白表达较shNC组和脂质体组均显著减少(表1，图2)。但shRNA1和shRNA2组间无显著差异；shNC和脂质体组间也无显著差异(表1)。VEGF主要定位于肿瘤细胞胞质中，血管周围可见较强表达。shRNA1和shRNA2组移植瘤的VEGF蛋白表达较shNC和脂质体组均显著减少(表1，图3)。但shRNA1和shRNA2组间无显著差异；shNC组和脂质体组间也无显著差异。

表1 各组移植瘤5-LOX和VEGF蛋白的表达强度

图2shRNA1组(a)、shRNA2组(b)、shNC组(c)和脂质体组(d)胰腺癌移植瘤5-LOX蛋白表达 (免疫组化 ×400)

图3shRNA1组(a)、shRNA2组(b)、shNC组(c)和脂质体组(d)胰腺癌移植瘤的VEGF蛋白表达 (免疫组化 ×400)

三、移植瘤5-LOX、VEGF mRNA表达的变化

shRNA1和shRNA2组移植瘤的5-LOX mRNA和VEGF mRNA的表达较shNC和脂质体组均明显减弱。但shRNA1和shRNA2组间未见明显差异；shNC和脂质体组间也未见明显差异(图4)。

图4shRNA1组(a)、shRNA2组(b)、shNC组(c)和脂质体组(d)胰腺癌移植瘤的5-LOX mRNA和VEGF mRNA的表达

讨 论

近年的研究表明，在胰腺癌组织、癌旁组织及其早期病变中均可见5-LOX的表达上调。Henning等[3]研究发现该基因在多种胰腺癌细胞中(PANC1、AsPC-1、MiaPaCa2)均有阳性表达，而在正常胰腺细胞中未见阳性表达，且5-LOX蛋白表达的强度与胰腺癌导管的分化程度呈正相关。国内也有报道，提示5-LOX与胰腺癌的发生发展密切相关[8]。近年研究发现，多种5-LOX代谢途径抑制剂MK886、雷公藤内酯醇和5-LOX的反义寡核苷酸可抑制胰腺癌增殖和诱导细胞凋亡[3,9-12]。新兴的RNA干扰技术因其具有高度的特异性，即双链RNA(dsRNA)特异地抑制、干扰RNA同源序列的靶基因表达，而对不相关序列的表达无干扰作用而成为目前国内外研究的热点，特别是在肿瘤基因治疗以及抑制病毒复制等方面具有良好的应用前景[13-14]。我们先期的研究从体外实验的水平评价了5-LOX的shRNA治疗对胰腺癌细胞的抑制作用，发现转染靶向5-LOX的shRNA质粒表达载体可显著下调5-LOX mRNA表达，也可以显著抑制SWl990细胞的增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡，提示采用基因技术封闭5-LOX蛋白表达，可以达到治疗目的[6]。本研究从体内实验的水平来进一步研究靶向5-LOX的shRNA治疗在胰腺癌方面的作用。结果显示靶向5-LOX的shRNA可以明显抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长，治疗组中5-LOX、VEGF的蛋白和mRNA的表达均明显低于对照组，提示靶向5-LOX的shRNA治疗可以直接抑制5-LOX的表达，从而达到抑制肿瘤生长的作用；也可以抑制VEGF的表达，抑制肿瘤血管的形成而起到间接抑制肿瘤生长的作用。

此次研究采用的方法为瘤内注射，相比尾静脉压力注射以及腹腔内注射给药，该方法可以使药物在瘤组织局部的浓度达到较高的水平，利于发挥治疗作用。但由于注射时采用中心注射的方法，考虑到注射部位是否有局部坏死以及药物通过压力扩散的程度不同，导致药物吸收的程度不同，因此各治疗组部分裸鼠移植瘤体积个体差异较大。提示在临床应用时应考虑到给药方式的优化，以便可以使药物定量稳定地进入瘤体内，以发挥稳定的抗肿瘤作用。

[1] Zhang J,Go VL.High fat diet,lipid peroxidation,and pancreatic carcinogenesis.Adv Exp Med Biol,1996,399:165-172.

[2] Woutersen RA,Appel MJ,Van Garderen-Hoetmer A,et al.Modulation of pancreatic carcinogenesis by antioxidants.Food Chem Toxicol,1999,37:981-984.

[3] Hennig R,Ding XZ,Tong WG,et al.5-lipoxygenase and leukotriene B(4) receptor are expressed in human pancreatic cancer but not in pancreatic ducts in normal tissue.Am J Pathol,2002,61:421-428.

[4] 赵崧，王兴鹏，徐刚，等.脂氧合酶对胰腺癌细胞增殖和凋亡的调节作用.中华消化杂志,2005,25:606-609.

[5] Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells1 Nature,2001,411:494-498.

[6] 张海峰，周国雄，丁晓凌，等.靶向5-LOX的shRNA诱导胰腺癌细胞的凋亡.世界华人消化杂志,2008,16:2107-2111.

[7] Naito S,von Eschenbach AC,Giavazzi R,et al.Growth and metastasis of tumor cells isolated from a human renal cell carcinoma implanted into different organs of nude mice.Cancer Research,1986,46:4109-4115.

[8] 吴深宝，周国雄，张弘，等.胰腺癌细胞中5-脂氧合酶mRNA和蛋白的表达.胰腺病学,2005,4: 238-239.

[9] 吴深宝，周国雄，张弘，等．雷公藤内酯醇调节5-脂氧合酶对胰腺癌细胞增殖的影响．中国肿瘤临床，2005，32：328-331．

[10] 周国雄，吴深宝，黄介飞，等.5-脂氧合酶特异性抑制剂对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响.中华消化杂志,2005,25: 689-691.

[11] 周国雄，吴深宝，黄介飞，等.5-脂氧合酶抑制剂齐留通对胰腺癌细胞SW1990的生长抑制作用.中国实用内科杂志,2006,26:1424-1426.

[12] 周国雄，吴深宝，丁晓凌，等.雷公藤内酯醇诱导胰腺癌细胞凋亡及对5-脂氧合酶和凋亡基因表达的影响.胰腺病学,2007,7: 113-115.

[13] Ngō H,Tschudi C,Gull K,et al.Double-stranded RNA induces mRNA degradation in Trypanosoma brucei.Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:14687-14692.

[14] Montgomery MK,Xu S,Fire A,et al.RNA as a target of double-stranded RNA-mediated genetic interference in Caeanorhabditis elegans.Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:15502-15507.

2009-05-06)

(本文编辑：吕芳萍)

TheeffectofsmallhairpinRNAtargeting5-LOXonthegrowthoftumorxenograftsinthenudemice

QINJin-dan,ZHOUGuo-xiong,HUANGJie-fei,DINGXiao-ling,ZHANGHai-feng,ZHANGHong.

DepartmentofGastroeterology,AffiliatedHospital,NantongUniversity,Nantong226001,China

ZHOUGuo-xiong,Email:zhouguoxiong@medmail.com.cn

ObjectiveTo study the efficacy of RNA interference targeting 5-LOX on 5-LOX and VEGF expression as well as the growth of tumor xenografts in the nude mice, in order to evaluate the value of the clinical application.MethodsSW1990 cells were injected into the back of BALB/c nude mice. Once the visible tumors were evidenced about 100mm3, the animals were divided randomly into 4 groups (6 animals/group) and treated with shRNA1 and shRNA2 targeting 5-LOX, negatrve control shRNA(shNC) or control LipofectamineTM2000(Lipo) by intratumoral injection. Observing the effect of the shRNA on the growth of tumor xenografts, investigating the expression of 5-LOX and VEGF by immunohistochemistry and RT-PCR.ResultsTwo nude mice were dead in shNC group and Lipo group because of the wasting disease. Other nude mice had no changes in body weight, spirit, appetite, and activity. The growth of tumor xenografts was suppressed potently when administered with shRNA. Compared with shNC and Lipo group, the mean tumor size in groups treated with shRNA was reduced markedly at every point of test time. Between two treat groups, they did not have significant difference. 5-LOX and VEGF were both expressed in the pancreatic cancer tissue. The level of the 5-LOX expression in shRNA groups was stronger than that in shNC or Lipo group. The VEGF had the same situation. Between the two treat groups, the difference was not significant.ConclusionsRNA interference targeting 5-LOX can inhibit the growth of tumor tumor xenografts in the nude mice by depressing the expression of 5-LOX directly and depressing the expression of VEGF indirectly.

Pancreatic neoplasms; RNA interference; 5-Lipoxygenase; Vascular endothelial growth factor

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.008

江苏省重点医学人才项目(RC 2007085) 江苏省卫生厅重大课题(K200602)

226001 南通，南通大学附属医院消化科

周国雄，Email:zhouguoxiong@medmail.com.cn