谷氨酸修饰的汞离子荧光探针的合成及性能研究

马立军， 陈丽平， 刘家熔， 龚 军， 杨丽庭

(华南师范大学化学与环境学院，广东广州 510006)

谷氨酸修饰的汞离子荧光探针的合成及性能研究

马立军， 陈丽平， 刘家熔， 龚 军， 杨丽庭*

(华南师范大学化学与环境学院，广东广州 510006)

该文报道了2种荧光探针分子(丹酰谷氨酸(DEA)和丹酰谷氨酸二甲酯(DE))，在它们的水溶液中加入牛血清白蛋白(BSA)，荧光探针分子的荧光发射增强.在水溶液中,DEA/BSA和DE/BSA的复合体系都可以对Hg2+产生有效的识别，识别信号来自于复合体系荧光发射峰的蓝移以及荧光强度的变化.

汞离子; 荧光探针; 谷氨酸

汞是重金属中毒害最大的元素，它一旦进入生物体，极易与生物体内蛋白质分子中的巯基(-SH)结合形成巯醇盐，在体内某些组织中累积、富集后造成慢性中毒，引起以神经损害为主的多种疾病[1-2]．因此，在生命、环境和医学等诸多领域中汞离子的检测具有非常重要的意义．利用传统的方法，如原子吸收光谱和等离子体发射光谱(ICP)、电化学和气相色谱等方法可以实现对Hg2+的检测[3-5]，它们的特点在于测定准确、干扰少、测量范围广并适用于环境水样的定量分析，但一般需要多步复杂的样品准备以及尖端的实验仪器，所以分析成本比较昂贵．也可以利用一些新兴的方法来检测Hg2+，如生物和纳米传感器、小分子比色探针以及荧光探针等传感器类来检测Hg2+，这些方法能较好地适用于快速、实时、原位定量检测和分析[6-8].近年来，荧光探针发展迅速，这主要由于它在溶液中容易使用，同时对痕量金属离子具有很高的选择性和灵敏度，因此很容易应用到重金属离子的检测[9-10]．另外，实现水溶液中Hg2+的检测才更具有实际意义，因此就要求荧光探针具有较好的水溶性．基于此，本文引入水溶性优异的氨基酸-谷氨酸作为金属离子的识别基团，设计、合成了2种氨基酸的衍生物-丹酰谷氨酸二甲酯和丹酰谷氨酸，期望通过含2个羧基的谷氨酸与荧光团-丹酰基团的结合，来实现在水溶液中识别重金属离子，特别是识别汞离子.

1 实验部分

1.1实验仪器和试剂

本实验核磁测试采用美国Varian公司的Varian NMR Systems 400MHz核磁共振波谱仪；质谱采用美国热电集团菲尼根质谱公司的LCQ Deca XP MAX液相色谱-质谱联用仪；荧光光谱测试采用日本日立FL-2500荧光光谱仪，本论文溶液样品所采用的激发波长均为340 nm；丹酰氯购于Alfa Aesar公司；谷氨酸和牛血清白蛋白购于百灵威公司；其它试剂为市售分析纯；金属离子均为氯化物形式.

1.2荧光探针分子的合成与表征

丹酰谷氨酸二甲酯(简称DE)和丹酰谷氨酸(简称DEA)的合成步骤如图1所示．

5.0 mL无水甲醇置于冰盐浴下冷却后，滴加0.70 mL氯化亚砜，再加入1.0 g谷氨酸，混合体系室温下搅拌2 h．然后将反应体系放入70～80 ℃水浴中回流30 min，之后蒸去大部分甲醇．再加入40 mL无水乙醚，有白色沉淀产生，体系在0 ℃下冷却2 h后过滤出沉淀，干燥后得到谷氨酸二甲酯盐酸盐1.1 g，产率77%[11]．

0.30 g谷氨酸二甲酯盐酸盐与0.28 g碳酸氢钠在水中反应15 min后，用氯仿萃取多次，得到淡黄色油状物谷氨酸二甲酯0.15 g，产率为63%．

图1 荧光探针分子的合成路线Fig.1 Synthesis route of fluorescent probes DE and DEA

0.20 g丹酰氯溶于少量无水丙酮中，冰盐浴下将其滴加到含0.11 g谷氨酸二甲酯和0.20 mL三乙胺的无水丙酮中，搅拌0.5 h后置于室温下继续反应12 h．反应完毕后蒸去丙酮，将得所固体粗产物溶于氯仿中，用饱和碳酸氢钠溶液洗至弱碱性，再用稀盐酸洗至弱酸性，最后用水洗至中性．经无水硫酸镁干燥后，蒸干氯仿得到的粗产物，用氯仿做展开剂进行硅胶柱层析分离，得到0.14 g黄色固体丹酰谷氨酸二甲酯，产率48%[12]．1H-NMR 谱(400 MHz，CDCl3)：8.580～7.209(m，6H)，5.452(d，1H)，3.927(m，1H)，3.589(s，3H)，3.272(s，3H)，2.900(s，6H)，2.299(m，2H)，2.044～1.778(m，2H).ESI-MS: 409.1.

将0.10 g丹酰谷氨酸二甲酯溶于40 mL 1 M的NaOH溶液中，室温搅拌0.5 h后基本溶解.用乙酸乙酯洗涤4次，除去没有完全反应的原料和副产物.水相中加入盐酸至弱酸性，再用乙酸乙酯萃取至水溶液中无荧光，此有机相用无水硫酸镁干燥.最后得到0.037 g黄色固体粉末丹酰谷氨酸，产率40%.1H-NMR 谱(400 MHz，DMSO-d6)：12.181(s,2H),8.418～7.195(m，6H)，3.685(m，1H)，2.788(s，6H)，1.984(m，2H)，1.798～1.535(m，2H).ESI-MS:379.1.

1.3实验测试溶液的配置

将丹酰谷氨酸二甲酯(DE)和丹酰谷氨酸(DEA)溶于DMSO中，分别配置成浓度为0.020 M的储备溶液. 取储备液分别配置成浓度为20.0 μM的含DMSO为2%(体积分数)的水溶液；分别配置1.0 mM的牛血清白蛋白(简称BSA)和5.0 mM的HgCl2、CdCl2、PbCl2、CrCl3、CuCl2、CoCl2、AlCl3的水溶液.

2 结果与讨论

2.1荧光探针与BSA相互作用的荧光光谱研究

在丹酰谷氨酸(DEA)和丹酰谷氨酸二甲酯(DE)的水溶液(20.0 μM)中分别加入不同浓度的BSA．如图2所示，随着不同浓度BSA的加入，DEA和DE的荧光发射峰发生明显的蓝移，DEA发射峰最大蓝移44 nm，而DE最大蓝移为33 nm；同时2个荧光发射峰都伴随着荧光强度的增加．这样的现象主要由于DEA、DE在与BSA作用时，其丹酰基团由水相转移到了蛋白质的疏水空腔中，从而屏蔽了氧气、溶剂分子以及其它因素引起的猝灭，使丹酰基团在结合蛋白质之后荧光量子产率得到明显的增加．同时，化学微环境的明显改变导致荧光发射峰产生了蓝移[13].这些结果反映出DEA、DE与BSA的结合表现出非常明显的光谱特征变化.

2.2DEA/BSA复合体系对Hg2+的识别

在DEA/BSA(摩尔比为1∶1)的复合体系中分别加入Hg2+、Cd2+、Pb2+、Cr3+、Cu2+、Co2+和Al3+.研究发现，不同的金属离子所引起的光谱变化明显不同，如图3所示. Cu2+的加入会引起DEA/BSA复合体系荧光强度的明显下降，Cr3+、Co2+的影响类似，这可能由于这些重金属离子具有较强的猝灭能力所致．Cd2+的加入对DEA/BSA体系荧光发射性质几乎没有影响，说明这类离子对DEA与BSA的相互作用影响很小或者没有影响．而Hg2+的加入会引起DEA/BSA复合体系荧光强度先增强后下降，并伴随荧光发射峰的蓝移(△max=17 nm)．另外，Pb2+的加入会引起复合体系荧光强度的增加，Al3+的影响类似．

图2 丹酰谷氨酸(a)和丹酰谷氨酸二甲酯(b)(20.0 μM)中加入不同浓度BSA的荧光光谱Fig.2 Fluorescence spectra of (a) DEA and (b) DE (20.0 μM) with different concentrations of BSA

图3 DEA/BSA(摩尔比为1∶1)复合体系中分别加入(a)Cu2+、(b)Cd2+、(c)Hg2+、(d)Pb2+的荧光光谱

Fig.3 Fluorescence spectra of DEA/BSA (mol/mol=1∶1) with different concentrations of (a) Cu2+, (b) Cd2+, (c) Hg2+, (d) Pb2+

通过比较这7种金属离子对DEA/BSA复合体系荧光光谱的影响可以明显看出，DEA/BSA复合体系对Hg2+表现出特异性识别，这种识别以荧光发射峰的强度变化(先增加后减小)以及峰位的蓝移为响应信号．DEA由水相进入到BSA的疏水空腔后，由于丹酰基团微环境极性的变化导致它的荧光发生蓝移并伴随荧光强度的增强(如图2(a)所示).而随后Hg2+的加入进一步促进了DEA荧光发射峰的蓝移，这说明Hg2+很可能诱导丹酰基团进入更为疏水的环境. 参照文献[14-15]，丹磺酰胺类化合物中，磺酰胺基团的氨基容易发生去质子化，并在去质子化后极易与金属离子结合.因此, 丹酰基团与BSA结合时，磺酰胺基团的氨基与蛋白质分子中的氨基酸残基产生氢键作用容易使其发生质子化，导致Hg2+与磺酰基团的氨基发生作用后使得整个丹酰基团进入BSA空腔更为疏水的部分，促使其荧光发射峰发生蓝移和荧光强度的变化，从而产生识别Hg2+的光谱特征. 对于机理的进一步分析也正在开展中.

另外，Pb2+和Al3+的加入也能够引起DEA/BSA复合体系荧光增强，也具有一定程度的识别效果，但是它们没有发生Hg2+那样的荧光峰蓝移，这显示了Pb2+和Al3+对DEA与BSA的结合产生了一定的影响，但效果不如Hg2+．以DEA最大发射波长在金属离子加入前后荧光峰位移的大小作为考察对象，来展示DEA/BSA复合体系对Hg2+所表现的特异选择性. 将7种不同的金属离子对DEA/BSA复合体系荧光性质的影响整理如图4所示．

图4 不同浓度金属离子的加入引起DEA/BSA(摩尔比为1∶1)复合体系荧光发射峰的位移

Fig.4 Fluorescence peak shift of DEA/BSA (mol/mol=1∶1) with different concentrations of metal ions

2.3DE/BSA复合体系对Hg2+的识别

对DE/BSA复合体系做相同的研究，结果显示，DE/BSA(摩尔比为1∶1)复合体系对Hg2+同样表现出选择性识别，Hg2+的加入引起体系荧光峰的蓝移(△max=17 nm)并伴随着荧光强度的下降(如图5所示)，但在低浓度时它的识别效果不如DEA/BSA复合体系．这可能是由于DEA、DE与BSA的相互作用存在差别(如图2)所致．而其它金属离子对DE/BSA复合体系荧光强度的影响也仅是不同程度的荧光猝灭，或者没有影响，类似于图3中的Cu2+或Cd2+．

图5 DE/BSA(摩尔比为1∶1)体系中加入Hg2+的荧光光谱

Fig.5 Fluorescence spectra of DE/BSA (mol/mol = 1:1) with different concentrations of Hg2+

3 结论

以高水溶性的谷氨酸作为金属离子的识别基团，将其与丹酰荧光基团化合得到2种水溶性较好的荧光探针分子-丹酰谷氨酸二甲酯(DE)和丹酰谷氨酸(DEA)．通过荧光光谱的测试发现，DEA/BSA和DE/BSA的复合体系都可以对Hg2+产生识别性结合，识别信号来自于复合体系荧光发射峰的蓝移以及荧光强度的变化. DEA/BSA和DE/BSA的复合体系在水溶液中对Hg2+的选择性识别效应为水介质中Hg2+的检测提供了一个可能的有效途径.

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Keywords： mercury ion; fluorescence probes; glutamic acid

【责任编辑 成 文】

THESYNTHESISANDMECHANISMSTUDYOFGLUTAMICACID-BASEDFLUORESCENTPROBESFORMERCURYION

MA Lijun, CHEN Liping, LIU Jiarong, GONG Jun, YANG Liting*

(School of Chemistry and Environment, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Two fluorescence probes are reported: dansyl-glutamic acid (DEA) and dimethyl-dansyl-glutamic acid (DE). The fluorescent emissions of fluorescence probes increase with the addition of bovine serum albumin (BSA) in the solutions of DEA and DE. The complexs of DEA/BSA and DE/BSA show specific selectivity for Hg2+in aqueous solution with blue-shift of fluorescence peak and intensity change.

2009-12-09

国家自然科学基金资助项目(20903041)

马立军(1981—),男,黑龙江人,博士,华南师范大学讲师, 主要研究方向：重金属离子荧光探针,Email: mlj898021@scnu.edu.cn;杨丽庭(1963—)，男，河北人，博士，华南师范大学教授，主要研究方向：高分子材料结构与性能，Email: yanglt63@yahoo.com.cn.

*通讯作者

1000-5463(2010)02-0067-05

O629.71

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