通化县产细辛的HPLC指纹图谱研究

张海丰,滕 坤,吴 艳

(通化师范学院,吉林通化134001)

细辛是常用中药,具有解表散寒、温肺化饮、祛风止痛等功效,主要药效成分是挥发油,并经药理实验证明具有解热、镇痛、镇静、抗菌、麻醉等药理活性[1]。2000版《中国药典》将北细辛Asarum heterotropoides Fr.Schm idt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.、汉城细辛Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai和华细辛Asarum sieboldii Miq.列为正品,并对细辛药材的一般质量指标如挥发油含量、杂质、灰分等作了规定[2]。但这种质量控制的标准尚不能全面反映细辛药材的内在质量。近年来, 中药指纹图谱技术已被用于中药的质量控制及鉴定, 其优点在于可以比较全面地反映中药复杂的化学成分及其相对比例[3]。本研究采用HPLC法对不同产地细辛药材进行指纹图谱研究,以期为控制其药材质量提供科学依据。

1 仪器与试药

Agilent 1100 系列高效液相色谱仪,美国安捷伦公司产品;ZK-82B型真空干燥箱,上海市实验仪器总厂产品;KQ-500型超声波清洗器,昆山市实验仪器有限公司产品;MP 21001 -电子天平,上海恒安科技仪器有限公司产品;FZI02型粉碎机,河北省黄骅市新兴电器厂产品。色谱甲醇,天津市康科德科技有限公司产品;水为娃哈哈纯净水;其他试剂均为分析纯。 5批细辛药材收集于通化县内,分别为金斗、英额布、欢喜岭、三颗榆树与富江5地。经通化师范学院于俊林教授鉴定为北细辛药材。药品具体位置见图1。

图1 各样品来源的具体位置

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent 1100 色谱柱(4.6 mm ×150 mm,5 μm);流动相为甲醇-0.2%甲酸水溶液,按表1梯度洗脱;流速lmL/min;检测波长287 nm;柱温为室温;进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.2 方法学考察

2.2.1 检测波长的选择

考察了240, 254, 270, 287, 300, 316 nm检测条件下的色谱图,结果表明, 287 nm色谱图峰形最好,出峰数目多,基线稳定,各色谱峰相互之间分离度较好, 故选择检测波长为287 nm[4]。

2.2.2 流动相梯度的选择

中药指纹图谱要求,所选定的色谱条件能够尽量多的检测出样品的有效成分,即走出尽量多的色谱峰,并且分离度良好。本实验比较了8个不同的流动相配比的梯度洗脱表程序对北细辛的分离度,其中有代表性的5个梯度条件见表2。

表2 5个不同的梯度洗脱条件

按表2的流动相配比及洗脱条件,经若干次试验结果表明:在条件IV下出的色谱图峰形最好,出峰数目多,基线稳定,各色谱峰相互之间分离度也较好。见图2。

图2 在条件IV下检测的北细辛样品色谱图

2.3 供试品溶液的制备

首先取5份50 g左右经干燥过的样品细辛,粉碎后过40目粒筛,然后分别精密称取3 g,加50 mL甲醇,再密封超声提取30 min,取上清液过0.22 μm微孔滤膜, 即可得到5 个地区的细辛的供试品溶液[4]。

2.4 细辛药材的HPLC检测

在条件IV下检测上述5个供试品溶液,得到以下5个图谱,见图3～7。

2.5 细辛药材指纹图谱的建立

对此5个批次的供试品进行检测,然后用中药指纹图谱相似度评价软件进行计算,得到 S1～S5的指纹图谱见图8。图中R为中药指纹图谱相似度评价软件生成的对照指纹图谱,由虚线串连的峰为5批次样品的共有色谱峰,共25个。

2.5.1 共有指纹峰的标定

在25个共有色谱峰中,按峰面积的大小,选择列前的6个峰作为指纹图谱的强峰,这6个强峰的总面积占总峰面积的50%以上。以金斗地区的色谱峰作为参比峰,计算各共有指纹峰的相对保留时间及相对峰面积值。结果见图9及表3, 4。

表3 6个共有指纹峰的相对保留时间

表4 6个共有指纹峰相对峰面积

由表3可看出, 6个共有指纹峰的相对保留时间一致性非常强, 每个共有指纹峰的 RSD为0.0%～0.46%,说明该细辛指纹图谱符合国家标准。从表4可以看出,在同一个品种中,各组分之间的含量比例比较稳定, 除 2 号峰外, 极差在0.307 237～0.844 371之间。表明本试验所建立的细辛指纹图谱不仅可以用作细辛的质量检测和控制,还可用于细辛的品种鉴别。

2.5.2 相似度评价

根据中药指纹图谱相似度评价软件,对样品S1～S5的HPLC色谱图与进行相似度分析,见表5。从表5中可以看出,除样品S1外,样品S2～S5与对照指纹图谱R的相似度均大于0.85,符合指纹图谱的要求。

表5 5批次细辛的指纹图谱与对照指纹图谱R的相似度

3 讨 论

本试验所建立的细辛HPLC指纹图谱,其方法学考察结果表明该细辛的指纹图谱符合国家中药指纹图谱的标准,其中发现共有25个共有色谱峰,并标定了其中占总峰面积50%的6个色谱峰为共有指纹峰。用于建立HPLC指纹图谱的5批次样品的相似度 0.771～0.941,相似度较高。本研究采用HPLC法对通化县不同产地细辛药材的指纹图谱进行了相似度分析,为全面控制药材质量提供了一定的研究基础。从相似度分析结果中可以看出,产于通化县部分地区的细辛药材之间相似度较高, 说明近距离产地的细辛药材之间存在的差异不大, 因此固定产地来源对保障细辛药材质量的稳定性极为重要。

[1]肖培根.新编中药志:第三卷[M] .北京:化学工业出版社, 2002:219.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M] .北京:化学工业出版社, 2005:185.

[3]洪筱坤, 王智华.中药数字化色谱指纹图谱[M].上海:上海科学技术出版社, 2003:18.

[4]吴芳芳.北细辛提取物的血中移行成分分析[D].哈尔滨:黑龙江中医药大学, 2008.