乙酰肝素酶在妊娠期高血压疾病大鼠肾脏的表达及低分子量肝素干预治疗

屈微 张延丽

(山西医科大学第一临床医院妇产科 山西 太原 030001)

妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的疾病,该病严重影响母婴健康。目前认为由高血压状态导致的全身及肾内多种细胞因子、血管活性物质等的改变在妊娠期高血压疾病中起着关键作用,这些异常改变导致多器官系统的损害(如肾脏、肝脏、心脏等),其中肾功能损害是其早期发病特征。发生机制尚不清楚,近年来研究发现细胞外基质(ECM)合成和降解失衡是各种原发性肾病或者继发性肾病发生、发展的重要原因。乙酰肝素酶(HPA)作为细胞外基质的降解酶,其表达变化可能是妊娠期高血压疾病肾脏损害的重要原因。

临床上无特效治疗妊娠期高血压疾病肾脏损害的药物,有使用肝素治疗的经验,但由于肝素易导致出血,故临床无推广,低分子量肝素(LMWH)是从普通肝素中提取出来的,具有出血副作用较少,生物利用度较高等特点,生物作用主要为抗凝、扩张血管、降低血压、减少肾小球基底膜细胞的增殖、降低尿蛋白等。

本实验通过制备妊娠期高血压疾病动物模型并用LMWH进行干预治疗,观察HPA在妊娠期高血压疾病大鼠肾脏组织中的表达变化及LMWH的治疗作用,并探讨妊娠期高血压疾病肾脏损害机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 实验动物 wistar大鼠45只,均为12～14周龄(山西医科大学动物实验中心提供),用亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)造妊娠期高血压疾病模型。

1.1.2 主要试剂 亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)(sigma公司)、低分子量肝素钙注射液:6000IU/0.6mL、兔抗鼠乙酰肝素酶多克隆抗体、即用型链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)试剂盒,二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒,磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol/L,pH7.4),枸橼酸盐抗原修复液(0.01mol/L,pH6.0)(武汉博士德公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型建立 体重为250～400g、12～l4周龄的wistar雌性大鼠,按雌雄2:1合笼,每日清晨取雌鼠阴道分泌物涂片,发现精子计为妊娠第1天。将妊娠鼠随机分为3组,每组15只。妊娠14d皮下注射L-NAME250mg/kg/d,建立妊娠期高血压疾病模型组；妊娠14d皮下注射L-NAME(上午)同期皮下注射低分子量肝素(下午)600IU/kg建立低分子量肝素干预组；正常妊娠组注射等量的生理盐水作为对照。3组均于妊娠第12天起每日测量大鼠尾动脉血压,隔日收集24h尿量测定尿蛋白。

1.2.2 标本收集 于妊娠21d将3组大鼠用1%戊巴比妥钠麻醉后行剖腹产手术,取出肾脏组织,立即用生理盐水洗净,10%甲醛固定24h,石蜡包埋切片,厚4μm,免疫组织化学SABC法染色。

1.2.3 免疫组织化学染色 肾脏组织标本固定48h,常规脱水石蜡包埋,4um厚切片。将组织切片与兔抗鼠乙酰肝素酶抗体共孵化,4℃过夜,生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)处理后,滴加SABC,DAB显色,苏木素轻度复染,脱水、透明、封片。用PBS替代一抗做阴性对照,阳性组织呈棕黄色,阴性组织呈蓝色。结果判断标准:在放大400倍下,每张切片随机选取5个视野,并用计算机图像分析系统软件计算其阳性区染色的光密度值(OD)进行半定量分析,求其OD均值作为阳性表达的比较值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 实验室检查结果

妊娠期高血压疾病大鼠于用药第2天开始即出现高血压、蛋白尿,结束分娩时伴有胎儿宫内发育迟缓等一系列病理学变化,与人类妊娠期高血压疾病的症状相似。妊娠期高血压疾病组大鼠的平均动脉压、尿蛋白明显高于正常妊娠组,2组比较有统计学意义(P<0.01)；而低分子量肝素干预组与妊娠期高血压疾病组相比,可见平均动脉压、尿蛋白显著降低,2组比较有统计学意义(P<0.01),但仍高于正常妊娠组水平,与正常妊娠组比较有统计学意义(P<0.01)(表1)

2.2 免疫组织化学结果

在妊娠期高血压疾病组中,乙酰肝素酶在肾小球中表达较正常妊娠组明显增强,2组比较有统计学意义(P<0.01)。在低分子量肝素干预组中,乙酰肝素酶在肾小球中的表达较妊娠期高血压疾病组明显减弱,2组比较有统计学意义(P<0.01)；仍较正常妊娠组的表达增强,与正常妊娠组比较无统计学意义(P＞0.05)(表2)。

3 讨论

乙酰肝素酶(HPA)是一种葡萄糖醛酸内切酶,于D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖苷结合部位切断硫酸乙酰肝素(HS)侧链,使HS长链逐段分解,释放多种与HS结合的活性因子如:碱性成纤维生长因子-2及其受体、血小板源性生长因子,抗凝血酶Ⅲ,肝细胞生长因子等,产生一系列生物反应[1]。细胞外基质主要成分中包含蛋白多糖及糖胺多糖,其主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)[2],是一种蛋白聚糖类碳水化合物,由一个核心蛋白通过糖苷键和数个与之共价连接的HS侧链组成。HSPG广泛存在于有脊椎动物和无脊椎动物组织ECM和细胞表面,它能与细胞表面及ECM中的活性分子结合,粘附于细胞表面,是ECM聚集和稳定的基础[3]。HS是HSPG的侧链,其N-和O-特异性硫酸化不但赋予HS高密度的负电荷,而且赋予HS与其它细胞外基质和生长因子相互作用的能力[1～2]。HPA能够切断细胞表面和细胞外基质中HSPGs上的HS侧链。

ECM构成肾小球基底膜(GBM)的基本网络状框架结构。蛋白尿的发生取决于肾小球滤过和肾小管重吸收,主要与肾小球的滤过功能有关。肾小球滤过膜由内皮细胞层、GBM和足细胞及其裂孔隔膜共同组成,GBM是其中重要的一层,对分子的滤过依赖于分子的大小、形状及所带的电荷,其多阴离子位点已被阳离子探针所证实。乙酰肝素酶(HPA)是目前发现唯一能够降解ECM中主要成分硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的蛋白水解酶。HPA在正常大鼠肾脏的肾小球不表达,而小管上皮细胞呈低表达[4]。在出现大量蛋白尿时尿液中HS含量明显增加[5]。蛋白尿的发生与GBM中HS侧链的减少有关,已经证实在不同的人类蛋白尿性肾小球疾病,如:系统性红斑狼疮肾炎、微小病变肾小球病、膜性肾病以及糖尿病肾病等GBM中HS的染色减少[6]。而随着对蛋白尿发生机制的深入研究,人们发现在病理状态下肾脏HPA的表达增高,突出表现在肾小球HPA的表达变化,说明HPA维持正常肾小管细胞的黏附与转归,而肾小球表达增高可能通过降解肾小球基底膜上的HS侧链,导致ECM和基底膜结构破坏,从而产生蛋白尿。肾脏组织中乙酰肝素酶的表达与妊娠期高血压疾病肾脏损害的发生发展有关。

表1 各组大鼠结束分娩时平均动脉压和尿蛋白

表2 各组肾脏组织乙酰肝素酶阳性反应光密度值

LMWH可显著降低蛋白尿排泄率[7]。可能与以下机制有关:抑制HPA活性,进而抑制HPA降解HS侧链,保护ECM和基底膜结构免受破坏；改善基底膜电荷屏障损伤,防止尿蛋白漏出；肾小球基底膜具有肝素受体,低分子肝素可能直接与该受体结合,代替HS发挥负电屏障作用阻止带负电荷的蛋白由基底膜漏出[8]。低分子量肝素对妊娠期高血压疾病肾脏损害具有一定的防治作用。

[1]Nagase H. Activation mechanisms of matrix metalloproteinases[J].BiolChem,1997,378(324):151～160.

[2]Denhardt DT ,Feng B ,Edwards DR,et al.Tissue inhibitor of metalloproteinases(TIMP,aka EPA):structure,control of expression andbiological functions[J].Pharmacol Ther,1993,59(3):329～341.

[3]杨荆,白云凯.基质金属蛋白酶及其抑制因子与肾脏疾病[J].云南医药,2005,26(1):60～61.

[4]Levidiotis V,Kanellis J,Ierino FL,et al.Increased expression of heparanase in puromycin am inonucleo side nephrosis[J].Kidney Int,2001,60(4):1287～1296.

[5]Mitsuhash i H,T sukada Y,Ono K,et al.Urine glycosaminoglycans and heparan sulfate excretion in adult patients w ith glomerular diseases[J].Clinical N eph ro logy,1993,39(5):231～240.

[6]Raats CJ,V an Den Bo rn J , Berden JH. Glomerular heparan sulfate alternation: M echanisms and relevance for proteinuria[J].Kidney Int,2000,57(2):385～400.

[7]Tamsma JT,Van der Woude FJ.Lemkes HHPJ.Effect of sulphated glycosa minoglycans on albuminueia in patients with overt diabetic nephropathy[J].Nephrol Dial Transplam,1996,11:182～185.

[8]Danne T,Spiro MJ,Spiro RG.Effect of high glucose on type collagen production by cultured glomerular epithelial,endothelial mesangial cells[J].diabetes,1993,42:170～177.