一种快速观察美味黑穗菌菌丝的新方法

褚福强，张敬泽，郭得平

（1.浙江大学生物技术研究所，杭州，310029；2.浙江农业大学园艺系）

美味黑穗菌(Ustilago esculenta)是寄生在菰草（Zizania latifolia）上的一种活体营养型真菌。美味黑穗菌侵染菰草后在茎的上部产生膨大结构，称为茭白，作为水生蔬菜而广泛种植。真菌侵染寄主后与寄主建立和谐的营养关系，以菌丝体的形式完成它的整个生活史，不像其他黑穗菌引起明显的症状[1～2]。然而，在人工栽培条件下，菰草可能逃避了美味黑穗菌侵染，不形成膨大结构，这些植株在生产上也被称为雄茭[3]。但迄今还不清楚雄茭形成的机制，早期诊断茭白和雄茭主要依据种植者经验和植株形态学细微特征，缺乏准确、迅速区分它们的有效手段。虽然一些细胞学研究为理解真菌与寄主互作的分子机制研究提供了细胞学基础，也为早期诊断茭白和雄茭提供了技术手段。但原先的细胞学观察需要复杂的样品处理过程（包括样品固定、系列脱水、包埋和切片等步骤）和相关设备[4，2]，限制了这些技术的广泛应用。

因此，本文主要报道一种简单、快速观察美味黑穗菌菌丝的新方法。利用该方法，不仅能有效观察真菌在寄主中的菌丝形态、菌丝分布，也能用于早期快速、准确诊断茭白和雄茭植株，也为研究雄茭形成的机制提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 试验材料

茭白品种浙茭2号和雄茭植株均来自浙江大学试验农场。

1.2 样品处理

分别从茭白和雄茭植株的不同部位（茭白、茎、根、芽和叶鞘）取样，用徒手切片切取组织样品，每个样品截面大小为 0.5 cm×0.4 cm，厚 20～30 μm。样品处理采用修改的Latude-Dada（1996）方法，包括样品脱色和染色过程。样品首先在脱色液（0.15%三氯乙酸溶解在3∶1（w/v）的乙醇和氯仿混合液中）中脱色，脱色时间依赖材料幼、老程度。收获时期的茭白脱色时间为 14～16 h，成熟的根、茎为 18～20 h，幼嫩叶鞘和芽为14 h。样品脱色后用蒸馏水漂洗3次，随后进行染色。用0.025%苯胺蓝乳酚油染色液对样品染色，染色时间依据材料的着色程度而定。收获时期的茭白、成熟的根和茎染色时间为3～4 h，幼嫩叶鞘和芽为4～5 h。染色后用蒸馏水对染色样色冲洗3次，然后用20%的甘油作浮载剂制片。如果个别样品染色过深，可将样品从载玻片再移入蒸馏水，在水平摇床上震荡褪色约1～2 h（视着色程度而定），或用70%的酒精代替蒸馏水进行褪色5～10 min（随后用蒸馏水漂洗3次）。

1.3 细胞学观察

细胞学观察和照相在具有Axiocam CCD摄像头和Axiovision数字成像软件（AxioVision Software Release 3.1.,ver.3-2002；Carl Zeiss Vision Imaging Systems）的Zeiss Axiophot 2显微镜上进行。以上处理的样品也可直接用于共聚焦显微镜[激光扫描共聚焦显微镜Leica TCS-SP 59（具有HCX PL APO CS 63×NA 1.3 glycerol immersion objective）]观察。

2 结果与分析

采用修改的Latude-Dada方法处理茭白植株样品，可清楚观察到美味黑穗菌在茭白植株不同器官中的菌丝分布。图1显示了真菌分布在茭白、茎、叶鞘和芽的维管束组织和薄壁组织中，这些正如原先描述的。但和原先的方法相比较，该方法由于对组织进行了脱色，增加了视野的景深，可观察到更多层次的信息，使图像有较强的立体感；而原先方法获得的图像仅是一个截面上的信息。所有该方法获得的图像，能提供真菌菌丝在寄主组织内更丰富的信息，扩大了理解真菌与寄主互作的细胞学特征视野。

真菌主要沿着寄主细胞间扩展，也可侵入寄主细胞中，通常在菌丝顶端产生不规则的、短而多的分枝，称为菌丝簇（hyphal clusters）；也可能产生大量的、类似酵母的细胞，形成菌丝聚集体（hyphal aggregations）。在成熟和幼嫩的组织中，真菌都能形成菌丝聚集体或菌丝簇。所以，美味黑穗菌在茭白植株中产生聚集体和菌丝簇是一个普遍特征。相比较，在雄茭植株不同器官上，都没有真菌菌丝存在。

由于苯胺蓝具有发色团，使切片组织细胞着色后，直接可在共聚焦显微镜下观察。在共聚焦显微镜下，图2清楚显示茭白芽组织中一个激光扫描纵截面——维管束中的真菌菌丝可沿着细胞间向维管束间组织扩展，并在薄壁束鞘（parenchymoutous bundle sheath）细胞间形成菌丝聚集体。同样，该方法处理的样品在共聚焦显微镜下不仅可获得二维图像数据，也可经计算机图像处理三维重建软件重新组，获得标本的三维结构，揭示亚细胞结构的空间关系（没有显示图）。

3 小结与讨论

本文采用修改的Latude-Dada（1996）方法。该方法已广泛用于研究炭疽菌属种（Colletotrichum species）在侵染寄主过程中的细胞学特征的观察[5～6]，但这些研究仅限于在寄主叶片上。本文研究表明，该方法用于组织切片，也能取得很好的染色效果。

如何减少雄茭的形成，是生产上亟待解决的问题。但由于雄茭形成机制研究的滞后，这一问题还未从根本上解决。然而，细胞学研究是观察植物成功地逃脱真菌侵染的最直接的方法，而本研究提供了研究雄茭形成机制的技术手段。

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图1 美味黑穗菌在浙茭2号品种不同器官中的菌丝分布显微图

图2 共聚焦显微图显示美味黑粉穗菌在浙茭2号品种幼芽中的菌丝分布