莲藕腐败病病原菌致病性及遗传差异性的研究

梁志怀，魏林，安哲宇

（1.湖南省植物保护研究所，湖南长沙，410125；2.中南大学研究生院隆平分院）

莲藕是近几年农业结构优化调整、生态农业发展的主要水生蔬菜之一，大田种植、池藕开发已成为农民增收的主要经济来源。莲藕腐败病为莲藕生产上的主要病害，给莲藕生产造成较大的损失，严重的可使莲藕商品价值减少60%以上[1]。由于藕农常习惯于周年和连年的重茬种植，该病的发生有逐年加重的趋势。莲藕腐败病的初侵染源是带菌的种藕和带病的土壤，最初发病受害部位为地下茎，不易观察，常失去最佳防治时期，化学防治收效不大。因此，利用抗病品种是防治莲藕腐败病最为有效的措施，这就有必要确定腐败病菌的致病力与优势种群。本文研究确定了测定莲藕腐败病菌致病性的快速、准确、简便鉴定的方法，并对供试菌株间的致病性分化与遗传背景间差异性的关系作了初步分析，结果如下。

1 材料与方法

1.1 供试病原菌

选取莲藕腐败病主要致病菌镰刀菌作为供试菌株，7个镰刀菌菌株中有5个菌株为不同区域发病藕上分离、纯化培养获得，另2个菌株为从百合、黄瓜枯萎病病株上分离、纯化培养获得。7个供试菌株来源分别为 F1：长沙县藕田病株；F2：湘乡藕田病株；F3：超市病藕；F4、F5：长沙市菜市场病藕；F6：百合枯萎病株；F7：黄瓜枯萎病株。

1.2 供试藕块

从藕田里取长势较为一致的健康嫩藕节，取中间段6 cm，从中间纵切后供试。

1.3 不同接种方法测定供试病原菌致病性[2，3]

①病原菌菌丝牙签接种 接种物培养：将供试镰刀菌移植于PDA培养基平板上，于25℃下恒温培养4～5 d，备用；选用软木质牙签，水煮2～3次（防止牙签上的化学酚类物质等抑制镰刀菌的生长），每次煮1 h，煮后用清水冲洗2～3次，晾至半干后将牙签尖部轻放于装有PDA培养基的培养皿中，牙签的尾部用灭菌的直径0.5 cm的滤纸托起，每皿放3根，将7个供试镰刀菌菌块（0.5 cm×0.5 cm）分别接种于培养皿的中央，置于25℃下培养，使病原菌从培养基向牙签上蔓延生长，当牙签从尖部被病原菌覆盖至牙签的1/4后，用于供试藕块的接种。

病原物接种：先用灭菌的大号注射针头在藕块要接种的部位刺1 cm深（防止直接用牙签插入时附着在牙签上的病原菌脱落），再将带菌牙签插入藕块接孔中，每孔接牙签2根，每藕块接3个孔。接种后的藕块置于（26±1）℃温度条件下的培养箱中保湿培养。

②病原菌菌丝块接种 藕块接种：将在PDA培养基上培养7 d的各供试镰刀菌用7 mm无菌打孔器在无菌的条件下，自菌落边缘切取菌饼，用接种器将菌饼接种于藕块的中央，菌丝面朝下，每藕块接种1个菌饼，接种后将藕块置（26±1）℃温度条件下的培养箱中保湿培养。

藕叶接种：配置植物营养液，将初展的嫩叶插入装有基本植物营养液的烧杯中，将藕块接种中制备的菌丝块接种在叶片距边缘8 cm处，相距10 cm放置1块，菌丝块上放置灭菌的棉花团保湿，再将藕叶连同烧杯置（26±1）℃温度条件下的培养箱中培养。以接种不含菌丝体的等体积琼脂块为对照。

③病原菌孢子悬浮液接种 病原菌孢子悬浮液的制备：将在PDA培养基上培养7 d的各供试菌株的菌丝体，加适量的无菌水清洗，用4层灭菌纱布过滤后，用无菌水将孢子量调整为1×108个/mL，制备成供试孢子悬浮液。

藕块接种：将纵切的藕块置于保湿的培养皿内，每藕块均匀喷雾15 mL孢子悬浮液，置于（26±1）℃温度条件下的培养箱中保湿培养。以喷雾蒸馏水为对照。

藕叶接种：采用与藕块接种的相同方法处理藕叶，将孢子悬浮液均匀地喷雾于叶片上，接种后的叶片连同烧杯置于（26±1）℃温度条件下的培养箱中培养。以喷雾蒸馏水为对照。

不同菌株藕块接种15块，叶片接种6片。9 d后记录各处理发病率；按调查的病级数，计算病指。

1.4 病害发病分级标准

根据腐败病在莲藕叶片、地下茎的发病特点，确定病害发病分级标准。

①接种藕块病级分级标准 0级：藕块生长正常、完好；1级：藕块有轻微病变，病变尚未侵入藕块组织；2级：藕块组织有明显病变，维管束呈褐色；3级：藕块维管束呈深褐色，变色部分占总面积的10%以下；4级：变色部分占藕块总面积的10%～30%；5级：变色部分占藕块总面积的30%以上。每个藕块为一计量单位。

②接种叶片病级分级标准 a.菌丝块接种叶片。0级：叶片上未见症状；1级：浅褐色病斑环在叶片上扩展 0～3.0 cm；3 级：水浸状病斑环在叶柄上扩展 3.0～3.5 cm；5 级：水浸状病斑环在叶柄上扩展 3.5～4.0 cm；7 级：水浸状病斑环在叶柄上扩展 4.0～4.5 cm；9 级：水浸状病斑环在叶柄上扩展4.5 cm以上。以每个菌丝块为一计量单位。

b.孢子悬浮液喷雾接种叶片。0级：无病症；1级：接种叶出现可见的褪绿小点或黄色小点；2级：接种叶出现1～5个黑色斑点；3级：接种叶上出现10个黑色斑点或叶尖出现黑斑；4级：接种叶上出现11～15个黑色斑点；5级：接种叶上出现16～20个黑色斑点；6级：接种叶上出现20个以上黑色斑点。整个叶片十字交叉分为4等份，每1份为1个计量单位。

1.5 供试病原菌遗传差异性分析

①供试病原菌菌丝体的培养 在PDA平板上培养5 d的供试菌株菌落边缘取10 mm×10 mm的菌丝块，转入100 mL的PD液体培养基中，25℃条件下摇床120 r/min震荡培养6 d，真空抽滤获得菌丝体后，分别用无菌水和灭菌的生理盐水洗涤2次后，45℃烘干备用。

②DNA的提取 具体操作参照曹宜等方法[4]，略作修改。

③引物筛选和RAPD扩增 从18条扩增条带数量适中、条带清晰可辨的随机引物（均由上海生工生物公司合成）中，进一步筛选出主带明显、稳定的3条随机引物作为试验用引物。其引物序列分别为：S6 5'TGCCGAGCTG 3'；S11 5'TGGACCGGTG 3'；S16 5'AGATGCAGCC 3'。

PCR反应体系总体积为25 uL。其中：模板DNA 1 μL（50 ng），随机引物 1 μL（约 5 pmol），10×PCR Buffer（含 Mg2+） 2.5 μL，dNTP 2 μL，Taq 酶 1 单位（U）0.5 U，加 ddH2O 至 25 μL。

PCR反应程序：94℃ 预变性4 min； 循环：94℃变性30 s,37℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，共35轮循环；循环结束后,72℃ 延伸8 min，16℃保温。

检验： 取 PCR 产物 7.5 μL 加 2.5 μL 上样缓冲液于2% 琼脂糖胶（含0.5 μg/mL溴化乙锭） 上稳压100～110 V电泳1.5 h。紫外检测仪观察、拍照。

④数据分析 根据供试菌株RAPD-PCR扩增条带的有无，以1，0记数。统计稳定、清晰的条带，采用DPS统计软件对数据进行系统聚类分析。

2 结果与分析

2.1 供试病原菌不同接种方法对寄主发病的影响

试验中采用5种方法对供试病原菌进行人工接种，接种藕块和叶片发病情况表明，所有接种方法都可导致接种体发病，且人工接种植株的感染症状与大田中自然发病的相同，在接种病株的再分离中所得病原菌的形态和培养性状与接种菌完全一致。

供试藕块和叶片发病情况见表1。如表1所示，所有供试菌株中以菌丝块对藕块接种所致发病率最高，且发病最严重，病情指数最高。用病原菌菌丝体牙签接种，藕块的发病率虽然也较高，但与菌丝块接种相比，无显著差异，但接种藕块的发病严重度则低于菌丝块接种。孢子悬浮液喷雾接种，则是叶片接种的较好方法，该方法接种病原菌后，叶片的发病率及发病程度均高于藕块的。试验结果还表明，不同接种方法，接种物出现症状的时间不同，菌丝块接种的藕块4 d左右即出现典型的症状，孢子悬浮液喷雾接种的叶片6 d左右才出现典型的症状。

表1 供试病原菌不同接种方式的发病程度

试验结果表明，用藕块进行腐败病病原菌致病性测定时，可选择病原菌菌丝块接种的方法；用藕叶进行测定时，可选择孢子悬浮液喷雾接种的方法。综合考虑接种物发病严重度，病情调查时记数的复杂性和接种后保湿效果好坏等因素，最适宜的方法应首选藕块菌丝块接种测定的方法。

2.2 不同来源病原菌对寄主致病性存在着分化

试验中所采用的5种接种方法测定莲藕腐败病菌的致病力，试验表明，供试的7个菌株间的致病力均表现出差异性，存在明显的致病性分化，但这种菌株间致病力差异与菌株地域来源并未表现出明显的相关性。并且，各供试菌株在不同接种方法下，其所表现出的致病力强度具有一致性，如F1菌株，其在5种不同接种方法下，均表现出较强的致病力；F6菌株在5种接种方法下，致病力表现得都较弱。从表1中还看出，从发病的藕块上分离的镰刀菌菌株对藕块、叶片致病力较强；从百合、黄瓜上分离获得的镰刀菌菌株对供试藕块、叶片也具有一定的侵染性。

2.3 不同来源病原菌遗传多样性

引物S16对6个供试镰刀菌病原菌菌株的RAPD扩增图谱见图1，根据扩增出的谱带绘制的聚类树状图。可以看出，来自同一植株（莲藕）的镰刀菌菌株间既有共同的特征性谱带，又有自己特异性的谱带，菌株间存在着较大的遗传多态性。这种多态性似乎同地域没有关系。如分离自湘乡藕田病株的病原菌与分离自超市病藕的病原菌遗传相似性非常高（但超市病藕产地不详）；与分离自长沙病株上的病原菌则存在较大的遗传距离。而来自百合和黄瓜两寄主的镰刀菌，与来自莲藕寄主的镰刀菌菌株多存在较大的遗传差距。

图1 引物S16对供试镰刀菌的RAPD扩增图谱

3 小结与讨论

笔者初步摸索了莲藕腐败病菌（镰刀菌）致病性测定的室内人工接种方法。结果表明，病原菌菌丝块对嫩藕藕块接种，可达到发病率高、发病程度高的效果，这为鉴定我国莲藕主产区不同致病菌之间的小种差异、莲藕抗病性品种的筛选提供了简便、易行、准确的抗性鉴定人工接种方法，但这种实验室内病原菌与藕块单纯的一对一的互作结果所筛选出的莲藕对病原菌的抗性与田间表现是否一致，还需要进一步研究。

试验结果表明，不同莲藕腐败病镰刀菌病原菌间致病力表现出了一定差异，对供试菌株基因组DNA应用RAPD技术进行多态性分析，结果表明，各菌株间存在一定的遗传多态性，因此确定莲藕主栽区腐败病致病菌是否存在生理小种的分化及其强致病性生理小种的筛选，对该病害的有效防治及抗病品种的选育，就显得尤为重要。此外，非莲藕寄主中分离获得的镰刀菌对莲藕也具有一定的侵染能力，能引起莲藕腐败病，在对莲藕腐败病进行防治及耕作时应对这些因素加以考虑。